BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  HOÀNG ĐỨC MINH TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  HOÀNG ĐỨC MINH TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. TS. Đào Thị Kim Oanh 2. DS. Lê Thị Thảo Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI-2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Hải Nam, TS. Đào Thị Kim Oanh, DS. Lê Thị Thảo - Bộ môn Hóa Dƣợc - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Những thầy cô đã tận tình hƣớng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Khoa Hóa – Đại học KHTN Hà Nội, Trung tâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam, Khoa Dƣợc – Đại học Quốc gia Chungbuk đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin đƣợc gửi lời biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn luôn ở bên khích lệ, động viên, giúp đỡ em trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014 Hoàng Đức Minh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………… 1 PHẦN I. TỔNG QUAN……………………………………………… 3 1.1. HISTON DEACETYLASE……………………………………… 3 1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase (HDAC)…………………… 4 1.1.2. Phân loại HDAC……………………………………………… 4 1.1.3. Cấu tạo của HDAC…………………………………………… 5 1.1.4. HDAC và ung thƣ……………………………………………… 6 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC…………………………………… 7 1.2.1. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC…………………………… 7 1.2.2. Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC…… 8 1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM………………………………………………………… 9 1.3.1. Thay đổi cầu nối……………………………………………… 11 1.3.2. Thay đổi nhóm khóa hoạt động………………………………… 12 PHẦN II. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………. 15 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ……………………………… 15 2.1.1. Hóa chất………………………………………………………… 15 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ…………………………………………… 16 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU…………………………………… 16 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………… 17 2.3.1. Tổng hợp hóa học……………………………………………… 17 2.3.2. Thử tác dụng sinh học………………………………………… 18 2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp đƣợc…. 20 PHẦN III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 22 3.1. HÓA HỌC……………………………………………………… 22 3.1.1.Tổng hợp hóa học……………………………………………… 22 3.1.1.1. Tổng hợp 3-methoxyimino-2 -oxoindolin và các dẫn chất… 22 3.1.1.2. Tổng hợp Ethyl 7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl) heptanoat và các dẫn chất…………………………………………… 25 3.1.1.3. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1- yl) heptanamide và các dẫn chất……………………………………… 28 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết………………………………………… 31 3.1.3. Xác định cấu trúc……………………………………………… 32 3.2. THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC………………………………… 37 3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC……………………… 37 3.4. BÀN LUẬN……………………………………………………… 38 3.4.1. Hóa học………………………………………………………… 38 3.4.2. Tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro……………………………………………………… 39 3.4.3. Đánh giá mức độ giống thuốc………………………………… 42 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………… 43 4.1. KẾT LUẬN……………………………………………………… 43 4.2. KIẾN NGHỊ……………………………………………………… 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALL : Bệnh ung thƣ nguyên bào lympho cấp tính APL : Bệnh ung thƣ bạch cầu tủy bào cấp tính CTCL : (Cutaneous T cell lymphoma) Tế bào lympho T dƣới da CTCT : Công thức cấu tạo CTPT : Công thức phân tử DCM : Dicloromethan DMF : N,N-Dimethylformamid DMSO : Dimethylsulfoxid EtOH : Ethanol GAPDH : Glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase HAT : Histon acetyltranferase HDAC : Histon deacetylase IC 50 : Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào IR : Phổ hồng ngoại MeOH : Methanol MS : Phổ khối lƣợng NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân RA : Acid retionic RAR : Receptor của acid retionic SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic SAR : Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng SKLM : Sắc ký lớp mỏng SW620 : Tế bào ung thƣ đại tràng TLC : Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng TSA : Trichostatin A DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang Hình 1 Sơ đồ cấu tạo của nucleosome 3 Hình 2 Vai trò cân bằng động của HDAC và HAT 4 Hình 3 Bảng phân loại HDAC 5 Hình 4 Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC 6 Hình 5 Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ 7 Hình 6 Cấu trúc cơ bản của các chất ức chế HDAC 8 Hình 7 SAR của các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic 9 Hình 8 Công thức cấu tạo của TSA và SAHA 11 Hình 9 Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 12 Hình 10 Các dẫn chất amid ngƣợc của SAHA 12 Hình 11 Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA 12 Hình 12 Cấu trúc của các chất tổng hợp 17 Hình 13 Tác dụng ức chế HDAC của các chất 4a-d 39 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1 Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng 9 Bảng 2 Các giá trị IC 50 của các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 14 Bảng 3 Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của 3-methoxyimino-2- oxoindolin và các dẫn chất 24 Bảng 4 Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của Ethyl 7-(3- methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl) heptanoat và các dẫn chất 27 Bảng 5 Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của N-hydroxy-7-(3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamide và các dẫn chất 30 Bảng 6 Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy T o nc của các acid hydroxamic 4a-d 31 Bảng 7 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất 4a-d 32 Bảng 8 Kết quả phân tích phổ khối lƣợng của các chất 4a-d 33 Bảng 9 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của các chất 4a-d 34 Bảng 10 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của các chất 4a-d 35 Bảng 11 Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 4a-d theo quy tắc Lipinsky 37 Bảng 12 Kết quả thử độc tính tế bào in vitro của các chất tổng hợp đƣợc 40 Bảng 13 Kết quả so sánh tác dụng ức chế dòng tế bào SW620 42 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Tên sơ đồ Trang Sơ đồ 1 Quy trình tổng hợp chung 22 Sơ đồ 2 Quy trình tổng hợp chất 2a 22 Sơ đồ 3 Quy trình tổng hợp chất 3a 25 Sơ đồ 4 Quy trình tổng hợp chất 4a 28 1 T V B c khe c ng là nhng v  c quan tâm  hu ht các quc gia trên th gic tính và thng kê ca T chc y t th gii (WHO) thì hàng u có khong 9-10 triu i mc bi và mt na trong s t nh này [10]. T chc Y t Th gic tính mng trên 6 trii ch l chm ti 12% trong s các nguyên nhân gây t vong  i [19].  c phát trin,  ng hàng th hai sau bnh tim mch.  ng hàng th ba sau bnh nhim trùng/ ký sinh trùng và tim mch [19].  gim thiu t l t c nghiên cu thuc chng ung u [19]. Trong nht c ch  thành các tác nhân chy trin vng. Acid suberoylanilid hydroxamic (Vorinostat, Zolinza ® ) là cht c ch c FDA cu tr u lympho t i da. Vorinostat là mt cht c ch HDAC có cha nhóm chc acid hydroxamic trong phân tt trong s các ch c nghiên cu phát trin t TSA là mt cht c ch HDAC t    a nhóm chc acid hydroxamic trong phân t. u này cho thy các cht c ch HDAC có cha nhóm chc acid hydroxamic rt có trin vu tr  [10,19]. Vì vy, chúng tôi ti tài : “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase vi 2 mc tiêu: [...]... hydroxamic Sau đây là tổng kết liên quan cấu trúc – tác dụng của một dãy các dẫn chất của acid hydroxamic đã được nghiên cứu [8] (hình 7): 9 Hình 7: SAR của các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic 1 .3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM: Từ những năm 90 của thế kỷ trước, rất nhiều nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu và hàng trăm bài báo... Các peptid vòng khó tổng hợp vì cấu trúc phức tạp - Các acid hydroxamic bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc lên các loại enzym HDAC 11 Trong số các nhóm trên, nhóm các acid hydroxamic tạo chelat bền vững với Zn2+ nhất và hầu hết các dẫn chất của acid hydroxamic đều ức chế HDAC ở nồng độ nM (các hợp chất còn lại đa phần ức chế HDAC với IC50 ở mức µM) Chính vì vậy, các acid hydroxamic đang được... dụng sinh học 2 .3. 2.1 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng SW620 Phân tích dựa trên Western Blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng a Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:... Chất rắn màu vàng da cam Tan trong aceton, DCM, DMF Khối lượng: 0, 237 g Hiệu suất: 93, 03 % Rf = 0,48 (DCM:MeOH = 9:1) Bảng 3: Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của 3- (methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất: Hiệu Chất CTCT CTPT KLPT Màu suất (%) 2a C9H8N2O2 176 Vàng 93, 96 2b C9H7N2O2F 194 Vàng 90 ,33 2c C9H7N2O2Cl 210,5 Vàng 90,70 2d C9H7N2O2Br 255 Vàng da cam 93, 03 25 3. 1.1.2 Tổng hợp Ethyl 7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)... hiện tác dụng ức chế mạnh HDAC [20] Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng khoảng cách tốt nhất giữa nhóm acid hydroxamic và phần (A) là 5, 6, 7 nguyên tử carbon, trong đó khả năng ức chế của dẫn chất mang cầu nối 6C lớn hơn so với cầu nối 5C hay 7C và tác dụng tốt hơn rất nhiều so với cầu nối 3C hoặc 4C [2 ,3, 6] Trong luận án Tiến sỹ Dược học của Đào Thị Kim Oanh (Việt Nam) [5] đã tổng hợp các acid hydroxamic. .. - Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên dòng tế bào ung thư đại tràng (SW620) 2.2 .3 Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp đƣợc 2 .3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 .3. 1 Tổng hợp hóa học 2 .3. 1.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết: - Tổng hợp N-hydroxy-7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamid và 3 dẫn chất - Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng và. .. N-hydroxy-7-(5-cloro -3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamid (4c) - N-hydroxy-7-(5-bromo -3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamid (4d) * Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 17 (Trong đó: 4a R=-H; 4b.R=-F; 4c R=-Cl; 4d R=-Br) Hình 12: Cấu trúc của các chất tổng hợp 2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp đƣợc - Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phương... 7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanoat và các dẫn chất (3a-d): a Tổng hợp Ethyl 7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanoat (3a): Quy trình tổng hợp Ethyl 7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanoat (3a) được tiến hành như sơ đồ dưới đây: DMF, K2CO3, KI 2a 3a Sơ đồ 3: Quy trình tổng hợp chất 3a  Tiến hành: - Cho 1mmol (0,176g) chất 2a và 1ml DMF vào bình cầu dung tích 50ml Kết hợp siêu âm cho tan hoàn...2 - Tổng hợp N-hydroxy-7- (3- (methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamid và 3 dẫn chất - Thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các chất tổng hợp được 3 PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) Hình 1: Sơ đồ cấu tạo của nucleosom Nucleosom là đơn vị cơ bản cấu tạo nên nhiễm sắc thể (NST) Mỗi nucleosom bao gồm 146 cặp base của ADN quấn quanh lõi histon octamer... 1: Quy trình tổng hợp chung Tác nhân và điều kiện: i) O-methylhydroxylamine hydroclorid, Triethylamin, ethanol, methanol, đun hồi lưu 70oC/24h; ii)7-bromoheptanoat, KI, K2CO3, DMF, tiến hành ở 80oC/3h; iii)Methanol, NH2OH.HCl, NaOH, -5oC/ 30 phút 3. 1.1.1 .Tổng hợp 3- (methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (2a-d): a Tổng hợp 3- (methoxyimino)-2-oxoindolin (2a) Quy trình tổng hợp 3- (methoxyimino)-2-oxoindolin . 3- methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase vi 2 mc tiêu: 2 - Tổng hợp N-hydroxy- 7- ( 3- (methoxyimino )-2 -oxoindolin-1-yl) heptanamid và 3 dẫn chất. - Thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính. NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  HOÀNG ỨC MINH TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3- METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON. -oxoindolin và các dẫn chất… 22 3. 1.1.2. Tổng hợp Ethyl 7- ( 3- methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl) heptanoat và các dẫn chất…………………………………………… 25 3. 1.1 .3. Tổng hợp N-hydroxy- 7- ( 3- (methoxyimino )-2 -oxoindolin- 1- yl)