BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN CHLOROFORM CHIẾT XUẤT TỪ CỎ SEO GÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN CHLOROFORM CHIẾT XUẤT TỪ CỎ SEO GÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. NCS. Nguyễn Duy Chí 2. Triệu Thị Nhung Nơi thực hiện: 1. Bộ môn dược liệu - Đại học Dược Hà Nội 2. Trung tâm Kiểm nghiệm Dược Quân đội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Những sự giúp đỡ quý báu ấy đã giúp tôi hoàn thành khóa luận này, đồng thời cũng cho tôi hiểu biết thêm nhiều điều về cách tư duy trong nghiên cứu khoa học. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Nguyễn Thái An, cô đã tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Ths.Nguyễn Duy Chí, DS. Triệu Thị Nhung đã tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện về hóa chất, trang thiết bị trong quá trình thực hiện và đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, các anh, chị trong Trung tâm Kiểm nghiệm Dược Quân đội, các phòng ban trong Trung tâm Kiểm nghiệm Dược Quân đội đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình và say mê trong nghiên cứu khoa học. Hà nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014. Sinh viên Nguyễn Thị Tuyết Nhung MỤC LỤC Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………… 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………3 1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ……….3 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Pteris L………………………………… 3 1.1.2. Đặc điểm chung của họ Cỏ luồng (Pteridaceae)……… ……… 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Pteris L……………………………………3 1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố của cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.).…………………………………………………………………… 4 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC…………………………………………… 5 1.2.1. Thành phần hóa học của chi Pteris L…………………………… 5 1.2.2. Thành phần hóa học của cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.)…….…6 1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ………………… ……………………………11 1.4. TÍNH VỊ - CÔNG DỤNG…………………………………………… 14 1.5. MỘT SỐ ĐƠN THUỐC……………………………………………… 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 16 2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU…………………………………… 16 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ………………………………16 2.2.1. Các trang thiết bị dùng trong nghiên cứu ………………………16 2.2.2. Hóa chất ………………………………………………………17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………17 2.3.1. Định tính…………………… ……… ……………… …………17 2.3.2. Chiết xuất và phân lập 17 2.3.3. Nhận dạng chất tinh khiết 18 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1. CHIẾT XUẤT 19 3.1.1. Xác định độ ẩm dược liệu 19 3.1.2. Chiết xuất 19 3.1.3. Định tính cắn phân đoạn chloroform bằng SKLM 22 3.2. PHÂN LẬP 25 3.2.1. Chuẩn bị cột 25 3.2.2. Tiến hành 26 3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 28 3.3. NHẬN DẠNG CÁC CHẤT PHÂN LẬP 30 3.4. BÀN LUẬN 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 KẾT LUẬN 35 ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ AST Ánh sáng thường BHA Butylated hydroxyanisol Dd Dung dịch DEPT Detortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH 2,2-diphenyl picrylhydrazyl C Chloroform CC Column chromatography CK Creatinin kinase H n-hexan IC 50 Half maximal inhibitory concentration KHV Kính hiển vi LPS Lipopolisaccharid MeOH Methanol MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid NMR Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance PCA Protocatechu aldehyd R f Hệ số di chuyển ROS Reactive Oxygen Spcecies SKLM Sắc kí lớp mỏng TT Thuốc thử UV 254 Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm UV 365 Ánh sáng tử ngoại bước sóng 365nm XDT Xanh da trời DANH MỤC BẢNG STT Ký hiệu Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1 Một số hợp chất phân lập từ cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.) 8 2 Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của một số hợp chất phân lập từ cỏ Seo gà 13 3 Bảng 3.1 Hàm lượng % của các cắn so với khối lượng bột dược liệu 20 4 Bảng 3.2 Kết quả định tính một số nhóm chất trong cắn chloroform 22 5 Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn phân đoạn chloroform bằng SKLM 24 6 Bảng 3.4 Kết quả SKLM của PM12 với 3 hệ dung môi ở AST và ở UV 254 29 7 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của PM12 32 DANH MỤC HÌNH STT Ký hiệu Tên hình Trang 1 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cắn các phân đoạn từ cỏ Seo gà 21 2 Hình 3.2 Sắc ký đồ của cắn C với hệ dung môi IV ở các điều kiện quan sát 23 3 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ cỏ Seo gà 27 4 Hình 3.4 Hình ảnh SKLM của PM12 với 3 hệ dung môi ở UV 254 28 5 Hình 3.5 Hình ảnh SKLM của PM12 với 3 hệ dung môi ở ánh sáng thường 29 6 Hình 3.6 Sắc ký so sánh PM12 với cắn chloroform 30 7 Hình 3.7 Ảnh chụp tinh thể PM12 dưới KHV vật kính 20 31 8 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất PM12 32 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Với vị trí địa lý và thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, thích hợp cho việc phát triển hệ thực vật phong phú và đa dạng, trong đó đặc biệt kể đến nhóm tài nguyên cây thuốc. Theo kết quả điều tra của Viện Dược liệu năm 2006, Việt Nam có 3948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc [1]. Tuy nhiên phần lớn các cây còn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo Y học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu kỹ và đầy đủ. Cỏ Seo gà là một trong 280 loài thuộc chi Pteris L. [39], [41], được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản [15]. Trong Y học cổ truyền Trung Quốc, cỏ Seo gà được sử dụng để điều trị các bệnh: eczema, hoàng đản, thổ huyết, viêm ruột, lỵ trực khuẩn… [24], bên cạnh đó cỏ Seo gà còn được biết đến với tác dụng chống ung thư và kháng khuẩn [25]. Ở Việt Nam, cỏ Seo gà vị đắng nhạt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, giảm đau được dùng để chữa kiết lỵ mãn tính, lỵ trực khuẩn, viêm gan, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở ngứa, bệnh ngoài da… [15]. Nhận thấy, cỏ Seo gà là một cây thuốc dân gian cần được quan tâm, tuy nhiên những nghiên cứu tổng thể về cỏ Seo gà còn ít và chưa thực sự đầy đủ. Từ năm 2012, Nguyễn Duy Chí và cộng sự đã tiến hành khảo sát, nghiên cứu thành phần hóa học của cỏ Seo gà và đã thu được các kết quả bước đầu. Nhằm khai thác nguồn nguyên liệu sẵn có ứng dụng trong phòng và trị bệnh song song với việc chứng minh kinh nghiệm sử dụng cỏ Seo gà trong dân gian góp phần bổ sung vào kho tàng cây thuốc Việt Nam một dược liệu mới, chúng tôi đã tiến 2 hành thực hiện đề tài “Phân lập một số hợp chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ cỏ Seo gà.” với những mục tiêu sau: 1. Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ cỏ Seo gà. 2. Nhận dạng chất phân lập dựa trên các dữ liệu phổ. Để thực hiện được mục tiêu đã đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau: 1. Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu. 2. Chiết xuất phân đoạn chloroform. 3. Phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn chloroform. 4. Nhận dạng chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ. [...]... Jianqun Liu và cộng sự phân lập được hai Pterosin dimers là đồng phân của nhau: bimutipterosin A và bimutipterosin B [25] 8 Ở Việt Nam, năm 2014 Hoàng Lê Sơn và Trần Huỳnh Phước Thảo công bố 2 hoạt chất chiết xuất từ dịch chiết ethanol 96% của cỏ Seo gà là : rutin và apigenin-7-O-β-D-glucopyranosid [22] Bảng 1.1 Một số hợp chất phân lập từ cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.) STT Tên hợp chất Công thức TLTK... dụng của cỏ Seo gà như: + Khả năng gây độc đối với dòng tế bào HL60 thử trên in vitro (dòng tế bào ung thư bạch cầu ở người): bằng phương pháp MTT, một số hợp chất pterosin secquiterpenes chiết từ Pteris multifida Poir đã được chứng minh có tác dụng gây độc đối với dòng tế bào HL60 thể hiện trong bảng 1.2 Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của một số hợp chất phân lập từ cỏ Seo gà STT Tên chất 1 2R,3R-13-hydroxy-pterosin... chất tinh khiết 21 Dược liệu Methanol Lọc Dịch chiết methanol Methanol thu hồi Cắn toàn phần Nước cất 600C Dịch chiết nước n-hexan Dịch chiết n-hexan Dịch chiết nước n-hexan thu hồi Chloroform Cắn H Dịch chiết chloroform Dịch chiết nước Chloroform thu hồi Cắn C Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cắn các phân đoạn từ cỏ Seo gà 22 3.1.3 Định tính cắn phân đoạn chloroform bằng SKLM - Dịch chấm sắc ký: Cắn mẫu... F4 F6 F5 Aceton 2/1 F7 Methanol F8 CC, Silicagel, n-hexan/aceton: 2,5/1 F8A F8C F8B F8D CC, Silicagel, dicloromethan/aceton: 2/1 Chất 3 (PM12) Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ cỏ Seo gà 28 3.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập  Hợp chất PM12 PM12 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi: Hệ I: Toluen: Ethylacetat: Acid formic (5:4:1)... [10] 2.3.2 Chiết xuất và phân lập - Chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol Tiếp tục chiết áp dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan, chloroform Thu được 2 phân 18 đoạn dịch chiết Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi đến cắn, tương ứng là cắn H, cắn C - Cắn C được dùng làm mẫu nghiên cứu để phân lập chất tinh... lần uống trong ngày chữa lỵ trực trùng [12] Chè tươi 100g, cỏ Seo gà khô 24g, nước 150ml, đun sôi giữ sôi trong 30 phút Chia hai hay ba lần uống trong ngày chữa lỵ trực trùng [12] Chữa lở loét, bệnh ngoài da: toàn thân cỏ Seo gà đốt thành than, tán bột, trộn với dầu vừng rồi bôi Có thế dùng cỏ Seo gà tươi giã đắp [15] Trị xuất huyết: cỏ Seo gà 60g, rễ cây muối 60g, sắc uống trong ngày [7] 16 CHƯƠNG... minh cỏ Seo gà liên quan đến tác dụng điều trị ung thư [46], [47] Rễ và lá cỏ Seo gà được dùng làm thuốc chữa tiêu chảy, đi ngoài ra máu, lỵ dưới dạng thuốc sắc hay thuốc ngâm rượu; nước sắc đôi khi còn thấy ra giun [12] Rễ, lá cỏ Seo gà sao vàng, tán nhỏ đun với dầu vừng thành thuốc dầu bôi chữa một số bệnh ngoài da cho trẻ em [12] Nước sắc lá cỏ Seo gà được sử dụng để chữa bỏng [15] 1.5 MỘT SỐ ĐƠN... tháng 5-10 [15] 5 Bào tử hình bốn cạnh, hơi tròn, màu vàng nhạt, có nhiều u sần nhỏ [15] Cỏ Seo gà có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản [15] Cỏ Seo gà có vùng phân bố tự nhiên khắp khu vực Đông và Đông Bắc Á Ở nước ta, cỏ Seo gà mọc phổ biến ở các tỉnh miền núi, trung du và đôi khi cả ở vùng đồng bằng Cỏ Seo gà là cây sống dai, có thể gặp ở trên những vách đá vôi, vùng đất cằn cỗi, xung quanh bờ giếng,... ký cột (CC) với chất hấp phụ là silicagel - Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập bằng SKLM với một số hệ dung môi khác nhau 2.3.3 Nhận dạng chất tinh khiết Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết được khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, dạng thù hình, độ tan, nhiệt độ nóng chảy Nhận dạng chất phân lập dựa trên các dữ liệu phổ 19 Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 CHIẾT XUẤT 3.1.1 Xác... Multifidosid A và multifidosid B được phân lập từ dịch chiết ethanol 95% có hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào HepG2 Nồng độ gây độc cho 50% tế bào lần lượt là 8,69µM và 9,26µM [47] 14 + Khả năng chống lại dòng tế bào MCF-7 (tế bào ung thư vú): Theo [22], từ dịch chiết cỏ Seo gà, nghiên cứu chiết xuất ra apigenin-7-O-β-Dglucopyranosid đã chỉ ra rằng cỏ Seo gà có hoạt động chống ung thư mạnh mẽ . Nam một dược liệu mới, chúng tôi đã tiến 2 hành thực hiện đề tài Phân lập một số hợp chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ cỏ Seo gà. ” với những mục tiêu sau: 1. Chiết xuất, phân lập một. bảng Trang 1 Bảng 1.1 Một số hợp chất phân lập từ cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.) 8 2 Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của một số hợp chất phân lập từ cỏ Seo gà 13 3 Bảng 3.1 Hàm. chiết xuất từ dịch chiết ethanol 96% của cỏ Seo gà là : rutin và apigenin-7-O-β-D-glucopyranosid [22]. Bảng 1.1. Một số hợp chất phân lập từ cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.) STT Tên hợp chất