P NG H P HÁ P S Ố TR Ư H IÊN C P XÁ C Ố CH Ấ KHÓA L Ư ỜNG Đ KIỀU C ỨU C ĐỊ N Ấ T P H L Á L UẬN T H BỘ Y ẠI HỌ C WY  THỊ B XÂ Y N H H À H ÂN L Á CÂ Y T ỐT N G H À NỘI TẾ C DƯỢ C ZX ÍCH H U Y DỰ N À M L L ẬP Đ Y GẠ O G HIỆP D - 2013 C HÀ N Ộ U Ệ N G P H L ƯỢ N Đ Ư Ợ O D ƯỢC S Ộ I H ƯƠ N N G M Ợ C T Ừ Ĩ N G M ỘT Ừ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI WY  ZX KIỀU THỊ BÍCH HUỆ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ LÁ CÂY GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu Nơi thực hiện: 1. Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội 2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây Gạo”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Nguyễn Thái An – Bộ môn Dược liệu, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền, DS. Phạm Lê Minh đã cho tôi những đóng góp quý giá về đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất - trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm và mỹ phẩm Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Kiều Thị Bích Huệ MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… CHƯƠNG I. TỔNG QUAN………………………………………….……… 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO…………………………………………… 1.1.1. Đặc điểm thực vật……………………………………….………… 1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo………………………………… 1.1.3. Bộ phận sử dụng………………………………………………… 1.1.4. Thành phần hóa học……………………………………………… 1.2. TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO…………………………………………. 1.2.1. Daucosterol……………………………………………………… 1.2.2. Stigmasterol……………………………………………………… 1.2.3. Mangiferin…………………………………………………… … 1.2.4. Lupeol…………………………………………………………… 1.2.5. Taraxeryl acetat……………………………………………………. 1.2.6. Taraxerol…………………………………………………….…… 1.2.7. 7α-hydroxysitosterol………………………………………… … 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)…………………………………………………… 1.3.1. Nguyên tắc của HPLC…………………………………………… 1.3.2. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký……………………… 1 2 2 2 2 3 3 4 4 5 6 7 8 9 10 10 10 11 1.3.3. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC………………………………… …. 1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS)…………… … 1.4.1. Nguyên tắc………………………………………………………… 1.4.2. Máy khối phổ………………………………………………….… 1.4.3. Ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất…….…. 1.4.4. Một số kỹ thuật LC-MS…………………………………………… CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….… 2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ…………… 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………… 2.1.2. Dụng cụ thiết bị……………………………………………………. 2.1.3. Hóa chất, thuốc thử……………………………………………… 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU…………………………………………… 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………… …… 2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử………………………………………………… 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chuẩn)…………………… …… 2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký……………………………… … 2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích……………………………… 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu………………………………………… CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ……………………… ……… 3.1. HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN………………… 3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu………………………………………… 3.1.2. Hiệu suất chiết…………………………………………………… 3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ……………………………………… 3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU…. 12 14 14 14 16 17 18 18 18 18 18 19 19 19 20 21 21 23 24 24 24 24 24 27 3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ……………………… 3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO BẰNG HPLC…………………………………… 3.5.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký…………………… …. 3.5.2. Độ lặp lại………………………………………………………… 3.5.3. Khoảng nồng độ tuyến tính………………………………………. 3.5.4. Độ đúng……………………………………………………… … 3.5.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ……… … 3.6. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO…… 3.7. BÀN LUẬN………………………………………………………… … 3.7.1. Về phương pháp xử lý mẫu……………………………………… 3.7.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký…………………………………….… 3.7.3. Về kết quả định lượng các chất trong lá cây Gạo…………………. 3.7.4. Về thẩm định phương pháp định lượng…………………………… KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………………… KẾT LUẬN………………………………………………………………… ĐỀ XUẤT………………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 30 32 32 34 34 39 42 43 43 43 43 44 44 46 46 46 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ESI: ion hóa bằng phun điện từ (Electronspray ionization) GC-MS: Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas chromatography–mass spectrometry) HO-1: Heme oxygenase – 1 HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao HUVEC: Tế bào thuộc màng trong ống dây rốn (Human umbilical vein endothelial cell) LC-MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Qualification) MeCN: Acetonitril MeOH: Methanol MS: Khối phổ (Mass Spectrometry) NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) PDA: Detector PDA (Photodiode Array) RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) S/N: Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise) SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SKĐ: Sắc ký đồ STT: Số thứ tự TP: Thành phần t R : Thời gian lưu UV-VIS: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible) DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ………………………………………. 15 Hình 1.2. Sơ đồ bộ tứ cực chập ba…………………………………………… 16 Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 7 chất nghiên cứu……………………………… 26 Hình 3.2. SKĐ của dịch chiết toàn phần lá cây Gạo………………………… 26 Hình 3.3. SKĐ của hợp chất mangiferin phân lập được từ lá Gạo …………… 27 Hình 3.4. SKĐ của hợp chất daucosterol phân lập được từ lá Gạo…………… 28 Hình 3.5. SKĐ của hợp chất 7α-hydroxysitosterol phân lập được từ lá Gạo…. 28 Hình 3.6. SKĐ của hợp chất lupeol phân lập được từ lá Gạo………………… 28 Hình 3.7. SKĐ của hợp chất taraxeryl acetat phân lập được từ lá Gạo…… … 29 Hình 3.8. SKĐ của hợp chất stigmasterol phân lập được từ lá Gạo………… 29 Hình 3.9. SKĐ của hợp chất taraxerol phân lập được từ lá Gạo……………… 29 Hình 3.10. Phổ khối lượng ứng với pic của mangiferin trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu…………………… 30 Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với pic của daucosterol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………… …… 30 Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với pic của 7α-hydroxysitosterol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………… ……. 31 Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với pic của lupeol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………… ……. 31 Hình 3.14. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxeryl acetat trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu…………………… 31 Hình 3.15. Phổ khối lượng ứng với pic của stigmasterol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………………… …. 32 Hình 3.16. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxerol trên SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………………… … 32 Hình 3.17. SKĐ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu)……………………….… 33 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Độ ẩm bột dược liệu…………………………………………….… 24 Bảng 3.2. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn…… 33 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất nghiên cứu…….…………. 34 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của mangiferin…….… 34 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của daucosterol……… 35 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của 7α-hydroxysitosterol…………………………………………… 36 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của lupeol…………… 36 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxeryl acetat…. 37 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của stigmasterol…… 38 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxerol……… 38 Bảng 3.11. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 7 hợp chất……………… 39 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng với mangiferin…………………………. 39 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng với daucosterol………………………… 40 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng với 7α-hydroxysitosterol……………… 40 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với lupeol……………………………… 40 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxeryl acetat…………………… 41 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với stigmasterol……………………… 41 Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxerol…………………………… 41 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/ml) …………………………. 42 Bảng 3.20. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong mẫu dược liệu nghiên cứu………………………………………… 42 [...]... thuốc có nguồn gốc dược liệu Do đó, đề tài Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây Gạo đã được thực hiện nhằm các mục đích sau: 1 Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã được phân lập từ lá cây Gạo bằng phương pháp HPLC 2 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng 7hydroxysitosterol, daucosterol, mangiferin,... hợp chất trong hỗn hợp 7 hợp chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong cao lỏng lá cây Gạo - Định tính các pic trên SKĐ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết nối - Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích - Áp dụng để sơ bộ xác định hàm. .. cộng sự đã phân lập được Daucosterol từ vỏ thân và lá cây gạo [12] Theo [40], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập được 120mg Daucosterol Theo [53], Daucosterol còn có trong rễ, thân, lá cây Plumbago zeylanica L với hàm lượng trong lá lớn nhất (từ 49,6mg – 96,7mg/100g dược liệu tùy theo thời điểm thu hoạch) Theo [26], từ 3kg hạt khô của cây Arctium lappa L phân lập được 30mg... hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích 2.3.2.2 Pha các dung dịch đối chiếu gốc Vì các chất khảo sát đều tan tốt trong methanol nên tôi quyết định chọn methanol làm dung môi để pha dung dịch chuẩn Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu đã phân lập. .. Stigmasterol được tìm thấy trong vỏ thân và lá cây Gạo [13], ngoài ra Stigmasterol còn được tìm thấy trong đậu nành bằng phương pháp HPLC [35] Theo [41], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập được 30mg Stigmasterol Theo [49], nghiên cứu đã phân lập được 65mg Stigmasterol từ 10g lá cây Rubus suavissimus, họ Rosoideae -6- 1.2.2.2 Tính chất - Công thức phân tử: C29H48O (M = 412,69 g/mol)... Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật MS/MS để định tính 7 hợp chất có trong lá cây Gạo - 18 - CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là lá của cây Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái tại Hương Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) và đã được TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh học) giám định. .. Qua nghiên cứu tính chất lí hóa của các chất và nghiên cứu một số tài liệu tham khảo, các dung môi thường sử dụng là methanol, acetonitril, acid formic, nước Tiến hành khảo sát với chế độ gradient dung môi giữa 2 kênh là A: acid formic 0,1% trong acetonitrile B: acid formic 0,1% trong methanol 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích Phép định lượng các chất trong lá cây Gạo bằng phương pháp HPLC được. .. tích - Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng 7 hợp chất trên có trong mẫu lá cây Gạo đã thu hái được 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi xử lý mẫu theo phương pháp ngâm lạnh  Xác định độ ẩm của bột dược liệu: Lá sau khi sấy khô, nghiền thành bột khô Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu Bật máy đo... của chất thử với chất chuẩn trên detector DAD (có hệ số match > 0,995) - Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS) - 13 - 1.3.3.2 Định lượng Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký là: - Phương pháp. .. methanol, acetonitril - 19 - - Các hợp chất đã phân lập được từ lá cây Gạo là mangiferin, lupeol, taraxerol, taraxeryl acetat, stigmasterol, 7-hydroxysitosterol và daucosterol đã được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và NMR 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích - Khảo sát các điều . Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây Gạo đã được thực hiện nhằm các mục đích sau: 1. Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một. hợp chất daucosterol phân lập được từ lá Gạo ………… 28 Hình 3.5. SKĐ của hợp chất 7α-hydroxysitosterol phân lập được từ lá Gạo . 28 Hình 3.6. SKĐ của hợp chất lupeol phân lập được từ lá Gạo ………………. hợp chất taraxeryl acetat phân lập được từ lá Gạo … … 29 Hình 3.8. SKĐ của hợp chất stigmasterol phân lập được từ lá Gạo ……… 29 Hình 3.9. SKĐ của hợp chất taraxerol phân lập được từ lá Gạo ……………