BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC TÚ NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI TRONG CHI GYMNEMA R.BR. THU Ở VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA HỌC HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC TÚ NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI TRONG CHI GYMNEMA R.BR. THU Ở VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA HỌC HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Phạm Hà Thanh Tùng Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 Lời cảm ơn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS Phạm Hà Thanh Tùng. Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và dìu dắt em trong quá trình làm Nghiên cứu khoa học và làm Khóa luận tốt nghiệp. Nhờ có sự dìu dắt của Thầy mà em đã trưởng thành lên từng ngày, học được nhiều điều bổ ích và hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Trần Văn Ơn và TS. Hoàng Quỳnh Hoa. Thầy cô đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm khóa luận và cho em những lời khuyên bổ ích trong học tập và nghiên cứu. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô trong bộ môn Thực vật. Các Thầy Cô đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này và Thầy Cô luôn là tấm gương sáng để em noi theo và học tập. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Chu Thị Thoa và các chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại Bộ môn. Tôi cũng xin gửi tới các bạn cùng làm Nghiên cứu và Khóa luận tại Bộ môn lời cảm ơn chân thành vì những giúp đỡ chân tình trong quá trình làm thực nghiệm. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ông bà, bố mẹ và xin gửi lời cảm ơn tới em trai đã giúp đỡ và động viên tinh thần con trong suốt những năm tháng học Đại học. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Nguyễn Ngọc Tú MỤC LỤC Danh mục từ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI GYMNEMA R.BR. 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.1.2. Thành phần hóa học 3 1.1.3. Tác dụng sinh học 7 1.1.4. Một số kết quả nghiên cứu đã tiến hành ở Việt nam 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC DƯỢC LIỆU 9 1.2.1. Phân tích hóa học bằng phương pháp dung môi phân đoạn 9 1.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) 9 1.2.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer chromatography) 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 18 2.1.1. Nguyên vật liệu 18 2.1.2. Thiết bị 19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 2.2.1. Định tính bột dược liệu 2 2.2.2. Xây dựng quy trình phân tích HPTLC 20 2.2.3. Tiến hành phân tích hóa học một số mẫu trong chi Gymnema R.Br. 20 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất trong các loài nghiên cứu 20 2.3.2. Xây dựng quy trình phân tích định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 27 2.3.3. Tiến hành phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết một số loài trong chi Gymnema R.Br. 28 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT CHÍNH 30 3.2. QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG 31 3.2.1. Sàng lọc phương pháp chiết xuất 31 3.2.2. Định tính các phân đoạn dịch chiết 32 3.2.3. Sàng lọc hệ dung môi pha động 33 3.3. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH CÁC DỊCH CHIẾT TOÀN PHẦN VÀ PHÂN ĐOẠN THEO QUY TRÌNH ĐỀ XuẤT 37 3.4. BÀN LUẬN 46 3.4.1. Về phương pháp nghiên cứu 46 3.4.2. Về định tính các nhóm chất chính 46 3.4.3. Về xây dựng quy trình định tính bằng HPTLC 47 3.4.4. Về phân tích định tính các mẫu theo quy trình đề xuất 48 KẾT LUẬN 52 ĐỀ XUẤT 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CHDCND Cộng hòa dân chủ nhân dân DAGA Deacylgymnemic acid HL Hồi lưu HPTLC High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) NK Ngấm kiệt NL Ngâm lạnh STZ Streptozotocin TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages UV Ultraviolet light (ánh sáng tử ngoại) VIS Visible spectrum (ánh sáng trắng) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R.Br ở Việt Nam theo Phạm Hoàng Hộ (2000) 2 Bảng 1.2 Một số tác dụng sinh học đã được công bố của các loài trong chi Gymnema R.Br 7 Bảng 1.3 Bảng tóm tắt quy tắc Stahl 11 Bảng 1.4 Một số hệ dung môi dùng trong phân tích TLC 11 Bảng 2.1 Danh mục mẫu được phân tích và mã hiệu 18 Bảng 2.2 Tóm tắt các phản ứng định tính các nhóm chất trong các loài nghiên cứu 22 Bảng 3.1 Kết quả các phản ứng định tính thành phần hóa học một số loài trong chi Gymnema R.Br. 30 Bảng 3.2 Kết quả khối lượng cắn thu được khi chiết xuất bằng các phương pháp khác nhau 31 Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả định tính saponin và flavonoid trong các phân đoạn dịch chiết 33 Bảng 3.4 Giá trị R f của các vạch đặc trưng chi Gymnema R.Br. 37 Bảng 3.5 Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số Nei&Li 44 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult. 5 Hình 1.2 Cấu trúc của Gurmarin 6 Hình 1.3 Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không đồng tan 10 Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch chiết NL, NK, HL với hệ dung môi (S.2), hiện màu dưới đèn UV 366nm 32 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu DM với hệ dung môi F.11 và S.2 hiện màu dưới đèn UV 366nm 35 Hình 3.3 Quy trình phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết bằng HPTLC 36 Hình 3.4 Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần và phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi S.2 38 Hình 3.5 Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần và phân đoạn ethylacetat với hệ dung môi F.11 39 Hình 3.6 Sự khác biệt giữa các mẫu của loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult. 42 Hình 3.7 Sự khác nhau giữa các mẫu của loài Gymnema inodorum (Lour.) Decnc. 43 Hình 3.8 Sự khác nhau giữa các mẫu của loài Gymnema latifolium Wallich ex Wight. 43 Hình 3.9 Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số tương đồng giữa sắc ký đồ của các mẫu 45 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) đã được sử dụng từ hơn 2.000 năm nay để điều trị Đái tháo đường [41], [43]. Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu đã được tiến hành để chứng minh tác dụng sinh học của cây và xác định hoạt chất chính trong cây, đó là acid gymnemic [36], [38] . Một hướng nghiên cứu mới đang được các nhà khoa học quan tâm áp dụng là tìm kiếm và sàng lọc tác dụng điều trị đái tháo đường tương tự Dây thìa canh từ các loài khác trong cùng chi Gymnema R.Br. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các loài cùng một bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng có tác dụng sinh học giống nhau [3]. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài Gymnema montanum Hook.f. [15], Gymnema inodorum (Lour.) Decnc [34], [33], Gymnema yunnanense Tsiang [44]… Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước được tập trung thực hiện trên 2 loài là Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult. [7] và Gymnema latifolium Wallich ex Wight. [3], [11]. Trong các nghiên cứu này, tác dụng hạ đường huyết đã bước đầu được chứng minh trên các mẫu thu hái ở trong nước. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào được thực hiện một các hệ thống về sự tương đồng trong thành phần hóa học của các loài trong chi Gymnema R.Br Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu phân loại các loài trong chi Gymnema R.Br. thu ở Việt Nam sử dụng vân tay hóa học HPTLC” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định tính các thành phần hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. - Xác định sự tương đồng về thành phần hóa học của một số loài trong chi Gymnema R.Br. và xây dựng cây phân loại thực vật chi dựa trên phân tích định tính thành phần hóa học. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1.TỔNG QUAN VỀ CHI GYMNEMA R.BR 1.1.1.Đặc điểm thực vật 1.1.1.1.Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, Chi Gymnema R.Br thuộc Họ Thiên lý (Asclepiadaceae) có vị trí phân loại như sau [39]: + Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) + Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) + Phân lớp Bạc hà (Lamiidae) + Bộ Long đởm (Gentianales) + Họ Trúc đào (Apocynacea) + Phân họ Thiên lý (Asclepiadaceae) + Chi Gymnema Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), ở Việt Nam có 07 loài thuộc Chi Gymnema R.Br được thể hiện trong Bảng 1.1. [8]. Bảng 1.1. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam theo Pham Hoàng Hộ (2000) [8] STT Tên khoa học Tên thường dùng 1 Gymnema acuminatum (Roxb.) Wall. Lõa ty nhọn 2 Gymnema albiflorum Cost. Lõa ty hoa trắng 3 Gymnema inodora (Lour.) Decne. Lõa ty không mùi 4 Gymnema latifolia Wall. ex Wight. Lõa ty lá rộng, Dây thìa canh lá to 5 Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult. Dây thìa canh, dây muôi, Lõa ty rừng 6 Gymnema reticulatum (Moon) Alston Cost. Dây thìa canh gân mạng 7 Gymnema tingens (Roxb.) Spreng. Rau mỏ, Lõa ty nhuộm [...]... Nhiều nghiên cứu sử dụng HPTLC trong xây dựng 17 fingerprint xác định các marker hóa học đặc trưng của các loài thực vật cũng như phân loại các loài và dưới loài và xây dựng thành bộ cơ sở dữ liệu để tra cứu [42] 18 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên vật liệu Mẫu lá của loài thu c chi Gymnema R. Br được trồng và thu hái ở những vùng khác nhau trong. .. về họ Thiên lý ở Việt Nam của Trần Thế Bách (2007), có 5 loài thu c chi Gymnema R. Br phân bố ở Việt Nam Đó là: Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst và Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Schult [2] 1.1.1.2.Đặc điểm thực vật và phân bố: Đặc điểm thực vật của chi Gymnema R. Br: Cây leo, không có r phụ trên thân Lá mọc... cao HPTLC của CAMAG với điều kiện tiến như trong quy trình phân tích đã xây dựng ở mục trên 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong các loài nghiên cứu Xác định các nhóm chất trong các loài: Gymnema sylvestre (Retz) R Br. , Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight và Gymnema yunnanense Tsiang bằng các phản ứng hóa học định tính thường quy 21 Trước... đến nay, các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học được tập trung vào loài Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br ex Schult với các nhóm chất triterpene saponin thu c 2 nhóm oleane và dammarane Saponin khung Oleane có các acid gymnemic và gymnemasaponins, trong khi đó saponin khung dammarane là các gymnemasides Trong lá còn xác định có resine, albumin, chlorophyll, carbonhydrates, acid tartric, acid formic, acid... của 26 mẫu trong chi Gymnema R. Br được thu thập từ các địa phương khác nhau trong cả nước; Xác định được hệ số tương đồng có giá trị 0,44 – 0,88 sử dụng chỉ thị RAPD 9 - Xác định sự có mặt của acid gymnemic trong dịch chi t methanol của 08 mẫu của 05 loài và gymnemagenin trong tất cả dịch chi t thủy phân - Định lượng phân đoạn giàu saponin triterpenoid (GX4) trong 08 mẫu trong đó mẫu của 2 loài cho... của Gurmarin 7 1.1.3.Tác dụng sinh học Cho đến nay, các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh chủ yếu được thực hiện trên loài Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br ex Schult và đã được công bố Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cũng được tiến hành trên các loài khác như Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight và Gymnema yunnanense Tsiang (Bảng 1.2) Bảng 1.2 Một số tác dụng sinh học đã... là Gurmarin (Hình 1.2), một polypeptid có khả năng làm mất cảm giác ngọt mà không ảnh hưởng tới các vị giác khác, được phân lập từ lá Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br ex Schult [25], [32] 5 Hình 1.1a Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult 6 Hình 1.1b.Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [37] Hình 1.2 Cấu trúc... F254 (Merck); phát hiện vết ở UV 366nm hoặc dùng thu c thử là dung dịch H2SO4 10%, sấy ở 90oC đến khi hiện màu Dựa vào kết quả định tính và sàng lọc thu được, đề xuất quy trình phân tích định tính các phân đoạn dịch chi t các mẫu đã thu hái và mã hóa trong Bảng 2.1 2.3.3.Tiến hành phân tích định tính các phân đoạn dịch chi t một số loài trong chi Gymnema R. Br theo quy trình đề xuất Tiến hành phân tích... tính các mẫu theo quy trình đề xuất Xác định các vạch đặc trưng chi và vạch đặc trưng loài: - Vạch đặc trưng chi là vạch sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thu c chi Gymnema R. Br khi tiến hành phân tích với cùng một hệ dung môi pha động và quan sát, hiện màu với cùng một phương pháp - Vạch đặc trưng loài là vạch sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghien cứu thu c cùng một loài nhưng không có ở. .. phấn trong mỗi ô phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy Cột nhị nhụy hình ống nhọn đầu [4], [2], [8] Phân bố ở Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia Ở Việt Nam, các loài thu c chi Gymnema R. Br phân bố ở nhiều vùng miền trên cả nước, từ Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình đến Thanh Hóa, Tây Nguyên, Tây Ninh [4] 1.1.2.Thành phần hóa học Cho . Nghiên cứu phân loại các loài trong chi Gymnema R. Br. thu ở Việt Nam sử dụng vân tay hóa học HPTLC được thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định tính các thành phần hóa học. 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC TÚ NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI TRONG CHI GYMNEMA R. BR. THU Ở VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA HỌC HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP. BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC TÚ NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI TRONG CHI GYMNEMA R. BR. THU Ở VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA HỌC HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP