BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: DS. Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Lê Ngọc Khánh, người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân đã đóng góp nhiều ý kiến quí báu và tận tình giúp đỡ em thực hiện đề tài. Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đối với em trong suốt quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ em trong học tập và trong cuộc sống. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Phạm Nguyên Phương MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Khái quát về bacteriocin 3 1.1.1. Vài nét về lịch sử 3 1.1.2. Phân bố 3 1.1.3. Danh pháp và phân loại 3 1.1.4. Tình hình nghiên cứu 4 1.2. Bacteriocin của vi khuẩn lactic 6 1.2.1. Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 6 1.2.2. Phân loại 7 1.2.3. Tính chất 8 1.2.4. Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng 9 1.2.5. Đánh giá hoạt tính bacteriocin 11 1.2.6. Chiết xuất và tinh chế 11 1.2.7. Ứng dụng 13 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1. Chủng vi khuẩn 16 2.1.2. Hóa chất 16 2.1.3. Môi trường 16 2.1.4. Máy móc, dụng cụ 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1. Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn L. acidophilus ATCC 4653 18 2.2.2. Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn L. acidophilus ATCC 4653 18 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 18 2.3.2. Phương pháp nhân giống L. acidophilus 19 2.3.3. Phương pháp xử lí sinh khối L. acidophilus 20 2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin theo cơ chế khuếch tán qua giếng thạch 20 2.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin 21 2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin 22 2.3.7. Phương pháp khảo sát khả năng chiết bacteriocin bằng (NH 4 ) 2 SO 4 22 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn L. acidophilus ATCC 4653 23 3.1.1. Xác định bacteriocin trong dịch lên men 23 3.1.2. Xác định bacteriocin trong sinh khối 26 3.2. Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn L. acidophilus ATCC 4653 28 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 28 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của 31 L. acidophilus ATCC 4653 3.2.3. Nghiên cứu khả năng chiết bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 bằng phương pháp kết tủa (NH 4 ) 2 SO 4 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC (American Type Culture Collection) Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì BC (Bacterial Cellulose) Cellulose vi khuẩn Dha Dehydroalanine Dhb Dehydrobutyrine FDA (U.S. Food and Drug Administration) Cục quản lí Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kì GC Guanine và Cytosine GRAS (Generally Recognized As Safe) Được công nhận chung là an toàn kDa kiloDalton LAB (Lactic Acid Bacteria) Vi khuẩn lactic Lan Lanthionine MeLan MethylLanthionine MRS de Man, Rogosa, Sharpe MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) Tụ cầu vàng kháng methicillin PMF (Proton Motive Force) Động lực proton SDS (Sodium Dodecyl sulfate) Natri dodecyl sulfat sp. (species) Loài subsp. (subspecies) Phân loài VRE (Vancomycin-Resistant Enterococci) Cầu khuẩn ruột kháng vancomycin UV (Ultraviolet) Tia cực tím DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Phân loại bacteriocin của LAB 8 2.1 Các hóa chất sử dụng trong đề tài 16 2.2 Các máy móc sử dụng trong đề tài 17 3.1 Kết quả xác định bacteriocin trong dịch lên men của L. acidophilus ATCC 4653 24 3.2 Kết quả xác định bacteriocin trong sinh khối của L. acidophilus ATCC 4653 26 3.3 Hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 ở các giá trị pH nghiên cứu trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis ATCC 6633 30 3.4 Hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 sau khi được xử lí nhiệt trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis ATCC 6633 32 3.5 Hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch thu được khi bổ sung (NH 4 ) 2 SO 4 vào dịch lên men của L. acidophilus ATCC 4653 với vi khuẩn kiểm định là B. subtilis ATCC 6633 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1.1 Biểu đồ thống kê số lượng các công bố liên quan đến bacteriocin trên Pubmed trong giai đoạn từ 1950 – 2010 5 3.1 Vòng ức chế tạo bởi dịch lên men của L. acidophilus ATCC 4653 trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis ATCC 6633 26 3.2 Vòng ức chế tạo bởi dịch lên men của L. acidophilus ATCC 4653 trên vi khuẩn kiểm định E. coli ATCC 25922 26 3.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 31 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 33 3.5 Sự thay đổi hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch theo nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 sử dụng 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc phát hiện ra các chất kháng sinh đánh dấu một bước tiến cách mạng của loài người trong cuộc chiến chống lại các bệnh nhiễm khuẩn, công nghệ kháng sinh được đánh giá là một trong những thành tựu khoa học lớn nhất của thế kỉ XX [52]. Tuy nhiên, bước vào thế kỉ XXI, con người đang phải đối mặt với kỉ nguyên hậu kháng sinh với sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới trong khi các chủng vi khuẩn kháng thuốc không ngừng gia tăng [13]. Trước tình hình đó, việc nghiên cứu và phát triển những hợp chất mới có tác dụng kháng khuẩn để giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh là hết sức cần thiết. Bacteriocin chính là một trong số đó [52]. Bacteriocin là những peptid hay protein có tác dụng diệt khuẩn do vi khuẩn sinh ra [34]. Chúng đã được phát hiện từ đầu thế kỉ XX nhưng mới được nghiên cứu rộng rãi trong một vài thập niên trở lại đây khi nhu cầu về những hợp chất kháng khuẩn nhằm thay thế kháng sinh và các chất bảo quản hóa học trở nên cấp thiết [26]. Với đặc tính an toàn đã được FDA xác nhận, vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm vi khuẩn sinh bacteriocin thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học [52]. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng ức chế vi khuẩn có hại của các bacteriocin sinh ra bởi LAB [20]. Nisin – một bacteriocin của Lactococcus lactis spp. đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới như một chất bảo quản nguồn gốc sinh học an toàn và hiệu quả [23]. Thành công của nisin đã bước đầu cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn của bacteriocin từ LAB [22]. Tại Việt Nam, bacteriocin của LAB đã bắt đầu được nghiên cứu trong những năm gần đây, tuy nhiên số lượng nghiên cứu chưa nhiều và tập trung chủ yếu trong nhóm ngành thực phẩm và thú y. Với mong muốn góp phần nhỏ vào nghiên cứu bacteriocin của LAB ở Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu [...]... học [26] Riley và Wertz nghiên cứu bacteriocin theo 3 nhóm: bacteriocin của vi khuẩn Gram (-), bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) và bacteriocin của vi khuẩn cổ [59] Chi tiết hơn, theo Desriac và cộng sự, bacteriocin được phân loại căn cứ nhiều tiêu chí, trong đó các tiêu chí cơ bản bao gồm: họ vi khuẩn sinh bacteriocin, trọng lượng phân tử, trình tự chuỗi acid amin và cấu trúc của đoạn gen (gene cluster)... được nghiên cứu 1.2 Bacteriocin của vi khuẩn lactic 1.2.1 Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin Vi khuẩn lactic (LAB) được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram (+), gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí (nonaerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính khi lên men carbohydrat LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các chi Lactobacillus, ... kháng khuẩn, giúp tăng tuổi thọ và tính an toàn cho sản phẩm [20] Để tăng hiệu quả kháng khuẩn, bacteriocin có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp khác như tạo môi trường acid, bổ sung NaCl…[34] 16 Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1 Chủng vi khuẩn a Vi khuẩn thử nghiệm Chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 b Vi khuẩn. .. gian đầu số lượng các nghiên cứu về bacteriocin không nhiều và hầu hết tập trung vào các bacteriocin của vi khuẩn Gram (-) Cho đến những năm 60 của thế kỉ XX, mới chỉ có 3 chi vi khuẩn Gram (+) được đi sâu nghiên cứu về khả năng sinh bacteriocin là Bacillus, Listeria và Staphylococcus [26] Tuy nhiên, cũng trong giai đoạn này, nisin và subtilin – 2 bacteriocin quan trọng từ vi khuẩn Gram (+) đã được phát... Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn L acidophilus ATCC 4653 - Xác định bacteriocin trong dịch lên men - Xác định bacteriocin trong sinh khối 2.2.2 Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn L acidophilus ATCC 4653 - Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin - Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin - Khả năng chiết...2 khả năng tạo bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: 1 Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn L acidophilus ATCC 4653 2 Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi L acidophilus ATCC 4653 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 Khái... lactis có khả năng ức chế nhiều vi khuẩn Gram (+) Nói chung, các bacteriocin của LAB thường ít thể hiện hoạt tính trên vi khuẩn Gram (-) [54] Bacteriocin có thể có tác dụng diệt khuẩn hoặc kìm khuẩn trên các chủng vi khuẩn nhạy cảm, mức độ tác dụng khác nhau do ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nồng độ, mức độ tinh sạch bacteriocin, các điều kiện thực nghiệm… [17] c Cơ chế tác dụng Cơ chế tác dụng của bacteriocin... colicin và các bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+) [66], từ đó định nghĩa về bacteriocin được mở rộng và đến ngày nay, các peptid và protein do vi khuẩn sinh ra có tác dụng diệt khuẩn đều được gọi là bacteriocin [34] 1.1.2 Phân bố Bacteriocin là sản phẩm phổ biến của giới vi khuẩn [34] Chúng đã được tìm thấy ở nhiều nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) và cả trên vi khuẩn cổ (Archaebacteria) [59] Đến... nguồn gốc từ vi khuẩn đường ruột như colicin [28] nhưng khối lượng phân tử nhỏ hơn và phần lớn được biến đổi sau dịch mã, tương tự nhóm lantibiotic ở vi khuẩn Gram (+) [35] Các bacteriocin từ vi khuẩn biển đến nay vẫn chưa được nghiên cứu nhiều tuy nhiên được dự báo là sẽ phát triển mạnh trong tương lai gần [26] b Vi t Nam Ở Vi t Nam, bacteriocin bắt đầu được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong... khuếch tán vào môi trường thạch cấy vi sinh vật kiểm định và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật nhạy cảm tạo ra vòng ức chế [65] Đo đường kính vòng ức chế tạo thành nếu có và đánh giá  Tiến hành: 21 - Làm hỗn dịch vi khuẩn kiểm định bằng cách thêm 5 ml nước cất vô trùng vào ống giống đặc của vi khuẩn kiểm định, gõ nhẹ thành ống nghiệm vào lòng bàn tay để vi khuẩn trên thạch phân tán vào nước . được nghiên cứu. 1.2. Bacteriocin của vi khuẩn lactic 1.2.1. Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin Vi khuẩn lactic (LAB) được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram (+), gồm các trực khuẩn. khoa học [26]. Riley và Wertz nghiên cứu bacteriocin theo 3 nhóm: bacteriocin của vi khuẩn Gram (-), bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) và bacteriocin của vi khuẩn cổ [59]. Chi tiết hơn, theo. nghiên cứu chưa nhiều và tập trung chủ yếu trong nhóm ngành thực phẩm và thú y. Với mong muốn góp phần nhỏ vào nghiên cứu bacteriocin của LAB ở Vi t Nam, đề tài Nghiên cứu 2 khả năng tạo