BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  LƯU THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO Bacillus subtillis natto BẰNG ALGINAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯU THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO Bacillus subtillis natto BẰNG ALGINAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Th.S. Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ Môn Công Nghiệp Dược HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới cô giáo ThS. Kiều Thị Hồng – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – trường đại học Dược Hà Nội và DS. Lê Ngọc Khánh, những người đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học. Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược - Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả các bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lưu Thị Hương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2 1.1. Cố định tế bào. 2 1.1.1. Khái niệm. 2 1.1.2. Phân loại. 2 1.1.3. Ưu nhược điểm của tế bào cố định. 4 1.1.4. Ứng dụng của cố định tế bào. 5 1.2. Tổng quan về alginat. 6 1.2.1. Cấu trúc hóa học. 6 1.2.2. Cơ chế tạo gel . 7 1.2.3. Tính chất của alginat. 8 1.2.4. Ứng dụng. 9 1.3. Bacillus subtillis natto. 10 1.3.1 Đặc điểm . 10 1.3.2. Nguồn gốc. 11 1.3.3. Phân loại khoa học 11 1.3.4. Cấp khí và nhiệt độ 11 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. 13 2.1.1. Nguyên liệu – Hóa chất. 13 2.1.2. Máy móc – thiết bị - dụng cụ nghiên cứu 14 2.1.3. Môi trường nuôi cấy. 14 2.2. Nội dung nghiên cứu. 15 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate tới cố định tế bào B. subtilis natto. 15 2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định. 15 2.2.1.2. Đánh giá khả năng cố định tế bào ở các nồng độ alginat bằng phương pháp đếm. 15 2.2.1.3. Định tính Enzym ngoại bào có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37 o C, 100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau. 15 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí tới cố định tế bào B. subtilis natto. 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu. 15 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto. 15 2.3.2. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginat. 16 2.3.3. Phương pháp phá hạt. 18 2.3.4. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính của các Enzym : Protease, cellulase, amylase. 18 2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục. 19 2.3.6. Phương pháp cấy trộn trong thạch. 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. 21 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định. 21 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào bằng phương pháp đếm 24 3.1.3. Định tính Enzym có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37 o C, 100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau. 30 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí tới quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT B. subtilis natto : Bacilus subtilis natto VSV : Vi sinh vật RSD : Độ lệch chuẩn CMC : Carboxymethyl cellulose Na CMC : Natri Carboxymethyl cellulose DANH MỤC CÁC BẢNG Tên các bảng Trang Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất 13 Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng 14 Bảng 3.1: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt calci alginat 2% 21 Bảng 3. 2: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt calci alginat 4%. 22 Bảng 3.3: Số lượng tế bào B. subtilis natto gói được trong 1 gam hạt gel calci alginat ở các nồng độ khác nhau. 23 Bảng 3.4: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt sau khi nuôi cấy (ở 37, 100 vòng/ phút, 24h) 24 Bảng 3.5: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1gam hạt Alginat 4% sau khi nuôi cấy (ở 37, 100 vòng/ phút, 24 giờ) 25 Bảng 3.6: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt gel ở các nồng độ alginat khác nhau sau khi nuôi cấy (ở 37 o C, 100 vòng/phút, 24 giờ) 26 Bảng 3.7: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch ( dịch sau khi nuôi cấy ở 37, 100 vòng/ phút, 24h) 27 Bảng 3.8: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch hạt alginat 4% ( dịch sau khi nuôi cấy ở 37, 100 vòng/ phút, 24h ). 28 Bảng 3.9: Số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy sau khi nuôi cấy ở 37 o C, 100 vòng/phút, trong 24 giờ. 28 Bảng 3.10: Sơ bộ thử hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy hạt calci alginat 2% 31 Bảng 3.11: Sơ bộ thử hoạt tính enzym trong dịch nuôi cấy hạt calci alginat 4% 32 Bảng 3.12: Số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt lắc ở 100 vòng/ phút trong 24 giờ 34 Bảng 3.13: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong 1 gam hạt lắc ở 150 vòng/phút trong 24 giờ. 34 Bảng 3.14: Số lượng tế bào B. subtilis natto được giữ trong hạt alginat 2% lắc ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút. 35 Bảng 3.15: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc ở 100 vòng/phút trong 24 giờ. 36 Bảng 3.16: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ. 36 Bảng 3.17: Số lượng tế bào B. subtilis natto có trong dịch lắc ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút. 37 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình Trang Hình 1.1: Cấu hình của  – D – mannuronic acid và -L- Guluronic acid. 6 Hình 1.2: Cấu trúc của phân tử alginat 7 Hình 1.3: Sự kết hợp ion Ca 2+ với alginat 8 Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc của B. subtilis natto 11 Hình 2.1: Phương pháp tạo hạt gel Calci alginat 17 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto phụ thuộc vào nồng độ alginat 23 Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto trong 1 gam hạt gel ở các nồng độ khác nhau 26 Hình 3.3 : Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B. subtilis natto trong dịch nuôi cấy (37 o C, 100 vòng/phút, trong 24 giờ) ở các nồng độ alginat khác nhau 29 Hình 3.4: Sô lượng tế bào VSV B. subtilis natto trong dịch nuôi cấy hạt Alginat 2% ở 100 vòng/phút và 150 vòng/phút. 39 . . 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, việc cố định tế bào sống trong gel alginat đã trở thành một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi. Cố định tế bào tuy là công nghệ mới và tiên tiến nhưng nó đã được sự quan tâm của các nhà khoa học và sản xuất bởi hiệu quả và tính kinh tế vượt trội của nó so với phương pháp truyền thống sử dụng tế bào tự do và cả kỹ thuật bất động enzym đã được nghiên cứu trước đó. Kỹ thuật cố định tế bào tiến hành đơn giản hơn, cho năng suất cao hơn và đặc biệt là có thể sản xuất liên tục trong các quy trình được tự động hóa. Vi khuẩn B. subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis là một trong các vi khuẩn có khả năng sinh protease và được ứng dụng nhiều [24]. Năm 1980, Giáo sư Sumi người Nhật phát hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym thuộc nhóm protease có khả năng phân giải fibrin [16]. Từ đó tới nay nhiều nghiên cứu về B. subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase [21], elastase [29], bacillopeptidase [27] Các chế phẩm của enzym này được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Alginat là chất mang hay được sử dụng nhất trong quá trình cố định tế bào. Nhưng vấn đề đặt ra là ở nồng độ bao nhiêu và điều kiện cấp khí bao nhiêu thì khả năng cố định tế bào của alginat là tốt nhất. Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng alginat” được thực hiện với 2 mục tiêu : 1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. 2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. [...]... môi trường ra vào tế bào bị cản trở - Hoạt lực của tế bào cố định thấp hơn tế bào tự do 1.1.4 Ứng dụng của cố định tế bào Với kỹ thuật cố định tế bào trên gel alginat, công nghệ sinh học đã công nghiệp hóa được một số công nghệ cao như sản xuất liên tục các loại rượu bằng việc cố định các tế bào nấm men, sản xuất acid hữu cơ, các chất kháng sinh và các hoocmon bằng việc cố định tế bào các vi khuẩn đồng... hơn nồng độ alginat có nồng độ 2% nên khả năng cố định tế bào cao hơn [9] 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào bằng phương pháp đếm  Mục tiêu: Xác định khả năng cố định tế bào trong gel alginat ở các nồng độ khác nhau  Tiến hành : - Nuôi cấy tế bào B subtilis natto theo phương pháp 2.3.1 - Cố định tế bào với nồng độ alginat 2%, 4% theo phương pháp cố định đã được... Nhận xét: Số lượng tế bào vi khuẩn B subtilis natto cố định trong 1 gam hạt gel calci alginat 4% vào khoảng 2,35x1012 – 9,5x1012 tế bào Có thể nhận thấy sự khác biệt về số lượng tế bào B subtilis natto khi thay đổi nồng độ alginat Số lượng tế bào cố định được tăng lên khi nồng độ alginat tăng từ 2% lên 4% Kết luận chung về khả năng cố định tế bào B subtilis natto khi thay đổi nồng độ alginat được trình... Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình cố định tế bào B subtilis natto 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat lên số lượng tế bào cố định  Mục tiêu: Xác định lượng tế bào được cố định trong gel alginat ở các nồng độ khác nhau  Tiến hành: - Nuôi cấy thu hỗn dịch vi khuẩn theo phương pháp được nêu ở mục 2.3.1 - Cố định tế bào vi khuẩn với các nồng độ alginat 2%, 4% theo phương pháp... bào cố định trong hệ gel của nấm men thấp hơn lượng tế bào vi khuẩn B subtilis natto - Do sử dụng 2 loại alginat khác nhau nên số lượng tế bào nấm men cố định được khác với tế bào vi khuẩn B subtilis natto cố định được Ở nồng độ alginat 4% Bảng 3.2: Số lượng tế bào B subtilis natto gói được trong 1 gam hạt calci alginat 4% Lần thí nghiệm Số lượng tế bào 1010 1011 1012 Lần 1 150 30 8 Lần 2 320 48 11 Trung... độ alginat Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào B subtilis natto phụ thuộc vào nồng độ alginat Nhận xét: Ở nồng độ alginat khảo sát từ 2% - 4%: Số lượng tế bào gói được trong 1 gam hạt gel của vi khuẩn B subtilis natto đạt giá trị trong khoảng 1011 - 1012 tế bào Tuy nhiên khi tăng nồng độ alginat từ 2% lên 4% số lượng tế bào tăng lên khoảng 10 lần (từ 1011 tới 1012 tế bào/ gam hạt) Số lượng tế bào. .. giá khả năng cố định tế bào ở các nồng độ alginat bằng phương pháp đếm 2.2.1.3 Định tính Enzym ngoại bào có mặt trong dịch sau khi nuôi cấy (ở 37oC, 100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí tới cố định tế bào B subtilis natto 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy B subtilis natto a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng Pha... CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Cố định tế bào 1.1.1 Khái niệm Cố định tế bào là sự bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên “một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn.[17] 1.1.2 Phân loại Phương pháp này được chia thành 4 loại [18]:  Cố định trên bề mặt chất mang rắn  Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel)  Keo tụ tế bào (tạo hạt)  Nhốt bằng phương pháp cơ học bên... vòng/ phút, 24h) số lượng tế bào vi khuẩn B subtilis natto cố định trong 1gam hạt gel Ca- alginat 2% vào khoảng 1,85 x – 3,5 x 1011 tế bào So sánh với bảng 3.1 ta thấy số lượng tế bào trước và sau khi nuôi cấy (ở 37 , 24 giờ, 100 vòng/ phút, 24h) đạt giá trị tương đương nhau ( khoảng 1011 tế bào/ gam hạt) Ở nồng độ alginat 4% Bảng 3.5: Số lượng tế bào B subtilis natto trong 1gam hạt Alginat 4% sau khi nuôi... lượng tế bào vi khuẩn cố định được theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5 và 2.3.6 Kết quả thu được trình bày ở bảng sau: Ở nồng độ alginat 2%: Bảng 3.1: Số lượng tế bào B subtilis natto gói được trong 1 gam hạt calci alginat 2% Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Lần 1 200 25 4 Lần 2 325 48 1 Trung bình 262,5 36,5 2,5 0,37 0,45 0,85 Độ lệch chuẩn (RSD) Nhận xét: Số lượng tế bào vi khuẩn B subtilis natto cố định . từ môi trường ra vào tế bào bị cản trở. - Hoạt lực của tế bào cố định thấp hơn tế bào tự do. 1.1.4. Ứng dụng của cố định tế bào. Với kỹ thuật cố định tế bào trên gel alginat, công nghệ sinh. khí lên quá trình cố định tế bào B. subtilis natto. 2 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Cố định tế bào. 1.1.1. Khái niệm. Cố định tế bào là sự bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn. trình cố định tế bào. Nhưng vấn đề đặt ra là ở nồng độ bao nhiêu và điều kiện cấp khí bao nhiêu thì khả năng cố định tế bào của alginat là tốt nhất. Vì vậy, khóa luận Nghiên cứu cố định tế bào