BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMIN TỪ CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMIN TỪ CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện 2. DS. Nguyễn Thị Phượng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện - nguời đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Nguyễn Văn Giang, ThS. Phạm Thị Hiền, DS. Nguyễn Thị Phượng và CN. Phan Tiến Thành cùng các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn. Em xin chân thành cảm ơn Đảng uỷ, Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là nguồn động viên to lớn đối với em trong cuộc sống và trong học tập. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, nên khóa luận không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Vân MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương I: TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 3 1.1.1. Cấu trúc, tính chất 3 1.1.2. Tác dụng dược lý 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ TETRAHYDROCURCUMIN 10 1.2.1. Cấu trúc, tính chất 10 1.2.2. Nguồn gốc tetrahydrocurcumin 11 1.2.3. Tác dụng dược lý 11 1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMIN 15 1.3.1. Phương pháp khử hóa với khí hydro có xúc tác 15 1.3.2. Phương pháp khử hóa với kẽm 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. NGUYÊN LIỆU 19 2.2. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ 20 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.4.1. Bán tổng hợp hóa học 21 2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết 22 2.4.3. Xác định cấu trúc 22 2.4.4. Thử tác dụng sinh học 22 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. BÁN TỔNG HỢP HÓA HỌC 23 3.1.1. Phản ứng khử hóa với tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% 23 3.1.2. Phản ứng khử với tác nhân là kẽm trong môi trường acid 26 3.1.3. Tóm tắt kết quả 30 3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 31 3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 32 3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR) 32 3.3.2. Phổ khối lượng (MS) 32 3.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) 33 3.4. THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC 33 3.5. BÀN LUẬN 36 3.5.1. Về bán tổng hợp hóa học 36 3.5.2. Về xác định cấu trúc 38 3.5.2. Về tác dụng sinh học 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 1. Kết luận 40 2. Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT AOM Azoxymethan APPH 2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroclorid BDMC Bisdemethoxycurcumin 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon ( 13 C - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DMC Demethoxycurcumin DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl đvC Đơn vị cacbon EtOH Ethanol h Giờ HHC Hexahydrocurcumin HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus) 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) H pư Hiệu suất phản ứng IC 50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibition concentration at 50%) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) KL, m Khối lượng LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low – density lipoprotein) MeOH Methanol MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) OD Mật độ quang (Optical density) OHC Octahydrocurcumin P Áp suất R f Hệ số lưu giữ (Retension factor) SKLM Sắc ký lớp mỏng SOD Superoxid sp Sản phẩm TBA Acid 2-thiobarbituric THC Tetrahydrocurcumin T o nc Nhiệt độ nóng chảy t Thời gian TLTK Tài liệu tham khảo V Thể tích xt Xúc tác DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số công trình nghiên cứu bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin 16 Bảng 2.1. Danh mục các nguyên liệu 19 Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ, thiết bị. 20 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H 2 /Pd(C) 25 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H 2 /Pd(C) 26 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/acid 28 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl . 29 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol kẽm/curcumin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl 30 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm 32 Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ khổi lượng của sản phẩm 33 Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của sản phẩm 33 Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH 34 Bảng 3.10. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD 35 Bảng 3.11. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC 50 của mẫu thử 36 Bảng 3.12. Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC 50 của mẫu thử 36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của curcumin 3 Hình 1.2. Bột curcumin 3 Hình 1.3. Phản ứng amin hóa β-diceton của curcumin 4 Hình 1.4. Dạng hỗ biến ceto – enol của curcumin trong dung dịch 4 Hình 1.5. Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch 5 Hình 1.6. Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm 6 Hình 1.7. Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcumin 10 Hình 1.8. Cơ chế chống oxy hóa của curcumin trong cơ thể sống 14 Hình 3.1. SKLM của THC trên hệ dung môi CH 2 Cl 2 : MeOH = 20:1 31 Hình 3.2. SKLM của THC trên hệ dung môi AcOEt: n-hexan = 7:3 31 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xa xưa, củ nghệ đã được sử dụng phổ biến ở một số nước châu Á như một thứ gia vị chính giúp điều hương, tạo mùi vị và màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm. Không những thế, nghệ còn được biết đến như một loại thuốc quý dùng để trị mụn nhọt, làm liền sẹo, làm lành vết thương,… và đặc biệt dùng để chữa các bệnh có liên quan đến dạ dày. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, người ta đã phát hiện ra nhóm chất màu curcuminoid – tuy chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ nhưng là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ. Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng quay trở về sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên, việc phát triển những hoạt chất có nguồn gốc thảo dược ngày càng trở thành mối quan tâm lớn đối với ngành Dược Việt Nam. Trong đó, nhóm chất màu curcuminoid được chiết xuất từ thân rễ của cây Nghệ vàng (Curcuma longa) đã thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học bởi các tác dụng sinh học quan trọng. Curcumin là thành phần chính được tìm thấy trong thân rễ cây Nghệ vàng, ngoài ra còn có các curcuminoid khác là demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin. Curcumin đã được nghiên cứu và chứng minh với các tác dụng dược lý như: chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, làm lành vết thương, làm liền sẹo, [3], [9]. Mặc dù curcumin có nhiều tác dụng quan trọng, tuy nhiên lại có nhược điểm là khó tan trong nước, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng khi sử dụng theo đường uống; do đó sinh khả dụng của curcumin thấp. Mặt khác, curcumin lại có màu vàng và khó rửa sạch nên nhu cầu sử dụng curcumin bị hạn chế, đặc biệt trong mỹ phẩm. Với những hạn chế của curcumin thì việc sử dụng curcumin trong các chế phẩm dùng ngoài da và mỹ phẩm dần được thay thế bằng tetrahydrocurcumin, một chất được bán tổng hợp từ curcumin. Tetrahydrocurcumin không có màu nên được sử dụng rộng rãi hơn, hơn nữa các nghiên cứu cũng cho thấy tetrahydrocurcumin có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư tốt hơn curcumin [17], [19], [25]. Tetrahydrocurcumin được coi là chất chuyển hóa [...]... của curcumin trong cơ thể, do đó nếu sử dụng tetrahydrocurcumin thay thế thì có thể khắc phục được nhược điểm sinh khả dụng kém của curcumin [19] Để góp phần nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu làm thuốc và làm phong phú thêm các dẫn chất curcuminoid, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với các mục tiêu sau: 1 Bán tổng hợp được tetrahydrocurcumin từ curcumin. .. hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy  Xác định cấu trúc sản phẩm bán tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)  Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm bán tổng hợp được bằng phương pháp DPPH và phương pháp SOD 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Bán tổng hợp hóa học  Bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin bằng phản... vào quá trình tổng hợp melanin [19] Như vậy, THC có thể sử dụng làm thành phần của các chế phẩm chống lão hóa và dùng ngoài để duy trì sức khỏe và sự mịn màng của da [19] 1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMIN Tetrahydrocurcumin có thể được tổng hợp toàn phần Tuy nhiên, trong phạm vi đề tài chỉ giới thiệu một số phương pháp bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin, bao... lại được hình thành nhiều hơn so với octahydrocurcumin [12] THC cũng có thể được bán tổng hợp từ curcumin bằng phản ứng khử hóa với các tác nhân khử khác nhau Nhiều tác giả đã bán tổng hợp được THC từ curcumin bằng phản ứng hydrogen hóa với sự có mặt của chất xúc tác 1.2.3 Tác dụng dược lý Tác dụng chống viêm: Curcumin và 4 dẫn xuất tổng hợp được nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm trong mô hình... tác Nhiều tác giả đã tiến hành khử hóa curcumin với khí hydro có xúc tác trong các điều kiện phản ứng khác nhau 16 Sơ đồ phản ứng chung như sau: O O O H3CO HO OCH3 OH curcumin H2/xt O H3CO OCH3 HO OH tetrahydrocurcumin Một số công trình nghiên cứu đã công bố được tóm tắt trong bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số công trình nghiên cứu bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin TT Tác giả 1 Uehara và cộng sự... NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 BÁN TỔNG HỢP HÓA HỌC Khóa luận đã thực hiện bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin bằng phản ứng khử hóa với hai tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trường acid 3.1.1 Phản ứng khử hóa với tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% Sơ đồ phản ứng: O HO O O H3CO OCH3 H2/Pd/C Curcumin OH O H3CO HO OCH3 Tetrahydrocurcumin OH Tiến hành phản ứng:... khô thu được 38mg THC, 380mg curcumin, 79mg demethoxycurcumin và 71mg bisdemethoxycurcumin [23] Các nghiên cứu cho thấy, trong cơ thể, tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, và octahydrocurcumin là những chất chuyển hóa của curcumin ở đường tiêu hóa [12], [15] Hexahydrocurcumin được tìm thấy ở mô gan cả chuột cái và chuột đực, trong khi đó ở chuột đực hình thành octahydrocurcumin nhiều hơn là THC, còn... nghiệm Trung Quốc 22 Pipet chia vạch 1mL, 5mL, 10mL Trung Quốc 23 Quả bóp cao su Đức 24 Tủ sấy Memmert Đức 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcmin theo sơ đồ sau: O H3CO HO O O OCH3 Curcumin OH [H] O H3CO HO OCH3 Tetrahydrocurcumin OH Tiến hành phản ứng khử hóa curcumin với hai tác nhân khử khác nhau là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trường acid Khảo sát các yếu... chuột cống Hoạt lực chống viêm của curcumin, các dẫn xuất của curcumin và phenylbutazon được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: Natri curcumin > tetrahydrocurcumin > curcumin > phenylbutazon> triethylcurcumin Khi so sánh curcumin và các dẫn xuất của nó trong các mô hình viêm cấp và bán cấp thì kết quả cho thấy các dẫn xuất của curcumin có tác dụng chống viêm mạnh hơn curcumin [19] Tác dụng chống oxy... trị pH khác nhau Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng cho thấy THC ổn định hơn curcumin trong dung dịch đệm phosphat pH = 7,2 (ở 37oC) cũng như trong huyết tương [19] 1.2.2 Nguồn gốc tetrahydrocurcumin THC có thể được phân lập trực tiếp từ nghệ Byeoung-Soo Park và cộng sự đã tiến hành phân lập THC và các curcuminoid khác từ củ nghệ khô bằng phương pháp sắc ký cột silica gel Từ 5 kg bột nghệ khô . bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl . 29 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol kẽm /curcumin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin. thế bằng tetrahydrocurcumin, một chất được bán tổng hợp từ curcumin. Tetrahydrocurcumin không có màu nên được sử dụng rộng rãi hơn, hơn nữa các nghiên cứu cũng cho thấy tetrahydrocurcumin. của curcumin [19]. Để góp phần nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu làm thuốc và làm phong phú thêm các dẫn chất curcuminoid, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu bán tổng hợp tetrahydrocurcumin