BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HỒNG HẢO KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHIỄM MYCOTOXIN TRONG NGÔ VÀ LẠC TẠI TỈNH BẮC GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HỒNG HẢO KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHIỄM MYCOTOXIN TRONG NGÔ VÀ LẠC TẠI TỈNH BẮC GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn TS. Phạm Thị Thanh Hà Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất 2. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Hà - Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các đồng nghiệp ở Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, những người đã hết lòng tạo điều kiện thuận lợi và trực tiếp giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Bộ môn Hóa Phân tích trường Đại học Dược Hà Nội đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy cô, cán bộ phòng quản lý sau đại học, các phòng ban khác của trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ emi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè luôn động viên, khích lệ em trong học tập và cuộc sống. Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Lê Thị Hồng Hảo MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 3 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Khái quát về độc tố vi nấm mycotoxin [4] 2 1.1.1. Giới thiệu chung về aflatoxin [12] 2 1.1.2. Giới thiệu chung về Fumonosin [20] 6 1.2. Hiện trạng và những công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài 8 1.3. Các phương pháp xác định mycotoxin 9 1.3.1. Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 9 1.3.2. Phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC) 10 1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11 1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 12 1.4. Giới thiệu về hệ thống LC-MS/MS 13 1.4.1. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao [3] 14 1.4.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) [2] 14 1.4.3. Ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.2. Trang thiết bị, hóa chất 16 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ,: 16 2.2.2. Hóa chất, thuốc thử 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Số lượng mẫu lấy: 18 2.3.2. Phương pháp kiểm nghiệm: 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1.Thẩm định phương pháp kiểm nghiệm aflatoxin 26 3.1.1. Tính đặc hiệu, tính chọn lọc 26 3.1.2. Khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 27 3.1.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 28 3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của hệ thống 29 3.1.5. Độ chính xác của phương pháp phân tích (độ đúng và độ chụm) 30 3.2. Thẩm định phương pháp kiểm nghiệm fumonisin B1 31 3.2.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc: 31 3.2.2. Xác định khoảng tuyến tính 33 3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 33 3.2.4. Khảo sát độ lặp lại của hệ thống 34 3.2.5. Độ chính xác của phương pháp phân tích (độ đúng và độ chụm) 35 3.3. Đánh giá mức độ ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc 36 3.3.1. Kết quả phân tích mẫu lạc nhân 36 3.3.2. Kết quả phân tích mẫu lạc củ 38 3.3.3. Kết quả phân tích mẫu ngô 40 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 41 4.1. Về Phương pháp phân tích aflatoxin (B1, B2, G1, G2) và fumonisinB1 bằng sắc ký lỏng khối phổ 41 4.2. Về kết quả thẩm định phương pháp phân tích 42 4.3. Về mức độ nhiễm các loại aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong lạc, fumonisinB1 trong ngô 42 4.4. Đánh giá các yếu tố liên quan ảnh hưởng đến tình hình ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc 43 KẾT LUẬN 44 5.1. Thẩm định phương pháp 44 5.2. Mức độ ô nhiễm Aflatoxin trong lạc, fumonisinB1 trong ngô: 44 5.3. Đề xuất giải pháp nhằm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm mycotoxin trong ngô, lạc 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC I 50 Phụ lục IA: Một số sắc đồ thẩm định các aflatoxins. 50 Phụ lục IB: Một số sắc đồ thẩm định các fumonisinB1. 55 Phụ lục II: Quy định của AOAC về độ thu hồi và độ lặp lại [22] 57 Phụ lục III: Chứng nhận kết quả mẫu liên phòng các Aflatoxins 58 Phụ lục IV: CÁC BẢNG KẾT QUẢ 59 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AF Aflatoxin AFB1 Aflatoxin B1 AFB2 Aflatoxin B2 AFG1 Aflatoxin G1 AFG2 Aflatoxin G2 BYT Bộ Y tế FAO Tổ chức nông lương thế giới Food and Agriculture Organization FB1 Fumonisin B1 OA Orchatoxin ISO Tổ chức tiêu chuẩn hoá thế giới International Standardization Organization IEC Hiệp hội kỹ thuật điện tử quốc tế International Electrotechnical Commission KPH Không phát hiện ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay LC Sắc ký lỏng Liquid chromatography MS Khối phổi Mass spectrometry LOD Giới hạn phát hiện Limit of Detection LOQ Giới hạn định lượng Limit of Quantification QCVN Quy chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức Assosiation of Official Analytical Chemists IP Điểm nhận dạng Identification point TLC Sắc ký lớp mỏng Thin HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao LC- MS/MS Sắc ký lỏng hai lần khối phổ UV Detector tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1: Aflatoxin nhiễm trên cơ chất lạc 3 Hình 1.2: Công thức hóa học của một số loại aflatoxin 4 Hình 1.3: Nấm mốc Fumonisin nhiễm trên ngô 6 Hình 1.4: Cấu trúc hoá học phân tử Fumonisin 8 Hình 1.5: Mô hình hệ thống LC-MS/MS 13 Hình 1.6: Bộ nguồn ion hóa 14 Hình 3.1: Sắc đồ phân mảnh của các aflatoxins 26 Bảng 3.1. Giá trị mảnh ion mẹ và hai ion con của các aflatoxins 26 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khỏang tuyến tính của các aflatoxins 27 Hình 3.2. Kết quả khảo sát khỏang tuyến tính của các aflatoxins 28 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của các aflatoxins 30 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của các aflatoxins 30 Bảng 3.6. Kết quả tham gia thử nghiệm liên phòng của các aflatoxins 31 Bảng 3.7. Giá trị mảnh ion mẹ và hai ion con của fumonisinB1 32 Hình 3.3: Sắc đồ phân mảnh của fumonisin B1 32 Hình 3.4: Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của fumonisin B1 33 Hình 3.5: Sắc đồ fumonisin B1 tại LOQ - 5 ng/ml 33 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại của các fumonisinB1 34 Bảng 3.9: Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp trên nền mẫu ngô 35 Hình 3.6. Tỉ lệ nhiễm Aflatoxin của các mẫu lạc nhân 36 Hình 3.7. Mối quan hệ tình trạng mẫu và sự nhiễm AF trong các mẫu lạc nhân 38 Hình 3.8. Tỉ lệ số mẫu lạc củ nhiễm aflatoxin 38 Hình 3.9. Mối liên hệ giữa tình trạng mẫu và số mẫu lạc củ nhiễm AF 39 Hình 3.10: Sắc đồ mẫu lạc có aflatoxin B2 với mức nhiễm là 8,8ppb 39 Hình 3.11: Sắc đồ mẫu lạc có aflatoxin B1 với mức nhiễm 6,6ppb 40 Hình 3.12: Sắc đồ mẫu ngô không có fumonisin 40 Hình 3.13: Sắc đồ mẫu ngô nhiễm fumonisin 0.86 µg/kg 40 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được quan tâm bởi nó liên quan trực tiếp tới sức khỏe của tất cả người tiêu dùng. Thời gian vừa qua trong nước liên tiếp phát hiện các vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có các vụ ngộ độc liên quan đến mycotoxin đã gây ra tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng khi lựa chọn thực phẩm cũng như việc sử dụng thực phẩm thế nào là đúng cách. Trong số 10.000 loại nấm mốc khác nhau được biết đến thì có khoảng 50 loại là có hại đối với gia súc gia cầm và con người. Các loại nấm này sản sinh ra các độc tố được gọi chung là mycotoxin. Mycotoxin là chất độc sinh ra từ nấm mốc, được hình thành khi nấm chuyển hóa các chất dinh dưỡng có trong thức ăn và nguyên liệu. Theo tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% số ngũ cốc thế giới có chứa một hàm lượng mycotoxin ở một mức độ nào đó. Tùy vào vị trí địa lý, khả năng nhiễm mycotoxin lại khác nhau. Ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới, nguy cơ nhiễm mycotoxin càng cao. Đặc thù khí hậu và nền sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam tình trạng nhiễm độc tố nấm mốc là khá phổ biến. Sự hình thành nấm mốc và độc tố của chúng có thể bắt đầu từ khi cây còn ở trên đồng, lúc thu hoạch, trong khi bảo quản hoặc ngay cả trong quá trình chế biến thức ăn cho vật nuôi. Không nơi nào trên thế giới có thể thoát khỏi nấm mốc và độc tố từ chúng, và tác hại của chúng là vô cùng to lớn đối với năng suất vật nuôi và sức khỏe con người. Với vai trò quan trọng của cây lương thực đối với đời sống con người cũng như nền kinh tế quốc dân, thì việc đánh giá các yếu tố nguy cơ có thể xảy ra đối với việc tiêu thụ thực phẩm là rất cần thiết đối với Việt Nam, vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá ô nhiễm mycotoxin trong thực phẩm với mục tiêu của đề tài là: 1. Thẩm định phương pháp xác định Aflatoxin(B1, B2, G1, G2) trong lạc và FumonisinB1 trong ngô bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS). 2. Áp dụng phương pháp đánh giá mức độ ô nhiễm từng Aflatoxin(B1, B2, G1, G2) trong lạc, fumonisinB1 trong ngô. [...]... thức tính cỡ mẫu mô tả: = (1 − ) Trong đó: p là tỷ lệ số mẫu bị ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc, theo nghiên cứu của Lê Văn Giang tại Tân Kỳ - Nghệ An là 96% trong ngô và 98% trong lạc d: độ chính xác tuyệt đối: 0,05 Z=1,96 với độ tin cậy α = 0,05 Từ đó ta tính được số mẫu ngô là n = 59 và số mẫu lạc là n = 30 Ta thực hiện lấy 60 mẫu ngô, 30 mẫu lạc nhân và 30 mẫu lạc củ 2.3.2 Phương pháp kiểm nghiệm:... kiểm tra đánh giá mức độ ô nhiễm mycotoxin gồm: lạc củ, lạc nhân và ngô mua tại các hộ gia đình và hộ kinh doanh tại địa bàn huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang Bằng cách ghi lại các thông tin về tình trạng mẫu phân tích và mối liên quan với các tính chất của mẫu đánh giá mối liên quan đến ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc 2.1.2 Nội dung nghiên cứu  Thẩm định phương pháp:  Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương... Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ  Độ chính xác của phương pháp (độ đúng và độ chụm)  Mẫu được lấy tại các hộ gia đình theo phương pháp lấy mẫu TCVN-5451 [8] và thực hiện khảo sát các yếu tố liên quan ảnh hưởng đến mức độ ô nhiễm mycotoxin  Áp dụng phương pháp đã thẩm định phân tích aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong lạc và fumonisinB1 trong ngô 2.2 Trang thiết bị, hóa chất 2.2.1 Thiết bị,... thực phẩm và biện pháp giảm nguy cơ ô nhiễm mycotoxin, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về đánh giá phơi nhiễm Aflatoxin Trong số các đề tài công bố gần đây như: Kết quả nghiên cứu của Lê Văn Giang, Phan Thị Kim và cộng sự Cục an toàn vệ sinh thực phẩm (2001) cho thấy kết quả khảo sát ban đầu xác định 95,4% trong số 243 mẫu khảo sát ngô và lạc ban đầu bị nhiễm AF, trong đó có 23,64% vượt quá giới hạn... 3: Kết quả có sai lệch - Khảo sát độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát Độ thu hồi (R%) được tính như sau: R%  Trong đó: C mc  C m  100 Cc Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ trong mẫu Cc: Nồng độ chuẩn thêm 2.3.2.4 Phương... zearalanone và α-zearalenol trong sữa bằng phương pháp UHPLC-MS/MS Mẫu sữa được làm sạch bằng cột chiết pha rắn Oasis HLB Giới hạn định lượng của các mycotoxins nằm trong khoảng 0,003 - 0,015 µg/kg Hệ số tương quan cao (R2 ≥ 0,996) thu được trong khoảng nồng độ mycotoxin 0,01 - 1,00 µg/kg với độ thu hồi cao (87,0 - 109%), độ lặp lại (3,4 - 9,9%) và độ tái lập phòng thí nghiệm tốt (4,0 - 9,9%) ở mức nồng độ. .. n = 13) và ngũ cốc ăn sáng ( n = 3) từ các thị trường Tunisia Mức độ nhiễm độc tố nấm mốc là 50% Wejdan Shakir Khayoon và cộng sự [32] sử dụng phương pháp HPLC detector huỳnh quang bước sóng 335 nm và 440 nm, khẳng định bằng LCMS/MS để xác định các độc tố fumonisin B1 và B2 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng cách sử dụng cột đá nguyên khối silica, thành phần pha động sử dụng methanol và đệm phosphate... không khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hòa tan trong dung môi phân cực cao nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn Các aflatoxin trong các dung môi chloroform và benzene bền vững trong nhiều năm nếu giữ trong tối và lạnh Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng Tuy nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao... [20] Trong các mycotoxin, mối quan tâm về các fumonisin ngày càng tăng cao Fumonisin là độc tố mới được phát hiện gần đây do Fumonisin moniliorme tổng hợp nên Đây là nhóm độc tính cao với động vật và con người Việc nhiễm fumonisin trong thức ăn cho người và gia súc ở quy mô trên toàn thế giới Riêng tại Mỹ, các báo cáo cho thấy 80 - 100% ngô bảo quản bị nhiễm fumonisin Hình 1.3: Nấm mốc Fumonisin nhiễm. .. độc tố vi nấm mycotoxin Độc tố nấm mốc còn gọi là mycotoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các sản phẩm nấm mốc và gây ngộ độc đối với động vật có vú, cá và gia cầm Những số liệu có giá trị về các mycotoxin và các bệnh về mycotoxin đã được thu nhận từ lĩnh vực thú y học Nghiên cứu về động vật thực nghiệm đã cho thấy tính độc . KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHIỄM MYCOTOXIN TRONG NGÔ VÀ LẠC TẠI TỈNH BẮC GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HỒNG HẢO KHẢO. (LOQ) 33 3.2.4. Khảo sát độ lặp lại của hệ thống 34 3.2.5. Độ chính xác của phương pháp phân tích (độ đúng và độ chụm) 35 3.3. Đánh giá mức độ ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc 36 3.3.1 KHẢO SÁT MỨC ĐỘ NHIỄM MYCOTOXIN TRONG NGÔ VÀ LẠC TẠI TỈNH BẮC GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn TS. Phạm Thị Thanh Hà Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc