BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THÙY DƯƠNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THÙY DƯƠNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh cùng toàn thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thùy Dương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trang DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 3 1.1.1. Phân loại khoa học 3 1.1.2. Nguồn gốc 3 1.1.3. Đặc điểm hình thái 3 1.1.4. Đặc điểm sinh lý 4 1.1.5. Đặc điểm sinh dưỡng 4 1.2. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto 4 1.2.1. Protease ngoại bào của B. subtilis natto 5 1.2.2. Nattokinase 6 1.3. Lên men sản xuất enzym từ Bacillus subtilis natto 8 1.3.1. Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym 8 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym của B. subtilis natto 9 1.4. Một số nghiên cứu về B. subtilis natto và nattokinase 12 1.4.1. Nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy vi sinh vật 12 1.4.2. Nghiên cứu về chiết tách và thu nhận enzym 14 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 15 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 15 2.1.3. Môi trường 16 2.1.4. Máy móc và dụng cụ 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1. Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtiils natto 17 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto 17 2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính các nhóm enzym 18 2.3.3. Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa 19 2.3.4. Phương pháp thử sơ bộ khả năng phân giải fibrin của các mẫu nghiên cứu 19 2.3.5. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm 21 Chương 3. KẾT QUẢ - THỰC NGHIỆM 22 3.1. Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto 22 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B. subtilis natto 26 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B. subtilis natto 26 3.2.2. Kháo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B. subtilis natto 30 3.2.3. Kết quả thử hoạt tính phân giải fibrin của các mẫu nghiên cứu 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic AS : Amoni sulfat ANOVA : Analysis Of Variance (Phân tích phương sai) bh : bão hòa CMC : Carboxy methyl cellulose E : Enzym FU : Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu) kDa : kilo Dalton mBar : mili Bar NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học) pI : Điểm đẳng điện của protein Điện di SDS – PAGE : Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của natri dodecyl sulfat TLPT : Trọng lượng phân tử t – PA : Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa plasminogen ở mô) VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của Bacillus subtilis natto 14 2.1 Nguyên liệu và hóa chất 15 2.2 Thiết bị được sử dụng 16 3.1 Đường kính vòng phân giải casein (d casein ) của dịch lên men ở các thời điểm khác nhau 22 3.2 Đường kính vòng phân giải tinh bột (d tinh bột ) của dịch lên men ở các thời điểm khác nhau 23 3.3 Đường kính vòng phân giải CMC (d CMC ) của dịch lên men ở các thời điểm khác nhau 23 3.4 Đường kính vòng phân giải cơ chất (  cơ chất ) của dịch lên chiết enzym ở các thời điểm khác nhau 24 3.5 Đường kính vòng phân giải casein (d cassein ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau 27 3.6 Đường kính vòng phân giải tinh bột (d tinh bột ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau 27 3.7 Đường kính vòng phân giải CMC (d CMC ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau 27 3.8 Đường kính vòng phân giải cơ chất (  cơ chất ) của dịch chiết enzym khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau 28 3.9 Đường kính vòng phân giải casein (d cassein ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau 31 3.10 Đường kính vòng phân giải tinh bột (d tinh bột ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau 31 3.11 Đường kính vòng phân giải CMC (d CMC ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau 31 3.12 Đường kính vòng phân giải cơ chất (  cơ chất ) của dịch chiết enzym khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác nhau 32 3.13 Đường kính vòng phân giải fibrin (  fibrin ) của các mẫu 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ STT Tên hình Trang 1.1 Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto 4 1.2 Cấu trúc của nattokinase 6 1.3 Cơ chế tiều fibrin của nattokine 7 3.1 Biến thiên hoạt độ enzym ngoại bào trong dịch lên men theo thời gian nuôi cấy B. subtilis natto 23 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt tính enzym ngoại bào trong dịch lên men 28 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới hoạt tính enzym ngoại bào trong dịch lên men 32 3.4 Thạch thử khả năng phân giải fibrin của các mẫu nghiên cứu với Nattospes 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, các bệnh có liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, thuyên tắc phổi… ngày càng tăng. Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 900.000 người mắc bệnh huyết khối tĩnh mạch. Trong đó, khoảng 300.000 ca tử vong [30], chi phí điều trị của 600.000 ca còn lại là từ 5,8 tới 7,8 tỉ đô la [17]. Ở Việt Nam, theo thống kê tại thành phố Hồ Chí Minh mỗi năm có khoảng 17.500 người bị đột quỵ do tai biến mạch máu não, trong đó có 9.000 người tử vong, đa số còn lại là sống thực vật hay mất khả năng lao động. Việc ngăn ngừa sự hình thành huyết khối có vai trò quan trọng để phòng ngừa và điều trị các bệnh này [13]. Trước đây, để điều trị bệnh huyết khối người ta sử dụng các chất chống đông như heparin và coumarin. Buớc sang những năm đầu thế kỉ 20, với việc phát hiện ra các enzym tiêu fibrin đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong điều trị bệnh huyết khối. Các enzym làm tiêu huyết khối là những chất có thể làm tan cục máu đông do hoạt hóa plasminogen thành plasmin là chất có thể phá vỡ, ly giải sợi huyết (fibrin). Streptokinase, urokinase là những enzym tiêu huyết khối điển hình. Tuy nhiên, chúng chỉ dùng đường tiêm truyền trong trường hợp điều trị cấp tính, không dùng để phòng bệnh được, việc sử dụng những thuốc này lại làm tăng nguy có chảy máu và các phản ứng dị ứng, mà chi phí điều trị lại cao [5], [62]. Hiện nay, các tác nhân làm tan huyết khối có trong nấm, tảo, thực phẩm lên men đang được nghiên cứu để cung cấp nguồn thuốc trị huyết khối an toàn, giá rẻ [6], [23]. Năm 1980, Giáo sư Hiroyuki Sumi đã phát hiện ra Natto - một loại thực phẩm truyền thống của người Nhật được lên men bằng cách ủ đậu tương nấu chín với Bacillus subtilis natto chứa enzym có khả năng tiêu firbrin mạnh là nattokinase . Đặc biệt, nattokinase còn dùng được đường uống nên có thể dùng để phòng bệnh [26], [58]. B. subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp nhiều enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase… Khi thay đổi các điều kiện môi trường như nhiệt độ, tốc độ lắc, dinh dưỡng, thời gian lên men… có thể ảnh hưởng tới hoạt độ các enzym của vi khuẩn. Việc lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu protease với hoạt độ cao nhất, đồng thời hạn chế sự tổng hợp các enzym còn lại đóng vai trò rất quan trọng trong [...]... 2.2.1 Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto  Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto  Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy (300C và 370C) tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B subtilis. .. protease, sau đó là nattokinase Do đó, khóa luận “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto được thực hiện với 2 mục tiêu: 1 Lựa chọn thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto 2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, tốc độ lắc) tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B subtilis natto 3 Chương... natto có mặt ba enzym ngoại bào: protease, amylase, cellulase [4], [15], [53] Quá trình sinh tổng hợp enzym ngoại bào của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ môi trường nuôi cấy Vì vây, thí nghiệm tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ ba enzym ngoại bào nói trên Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh một số enzym ngoại bào của. .. B subtilis natto là 24h Tiếp tục chọn 24h là thời gian lên men cho các nghiên cứu tiếp theo 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B subtilis natto 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B subtilis natto Các kết quả của các nghiên cứu trước đây đã xác định trong môi trường nuôi cấy B subtilis. .. tiêu diệt các tế bào vi sinh vật 10 a) Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ môi trường và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym của VSV cũng như tính chất của enzym được tổng hợp Ví dụ khi nuôi Bacillus coagulans ở 350C và 550C thì amylase sinh ra có khả năng chịu nhiệt khác nhau Amylase thu nhận khi nuôi ở 350C bị mất 90 – 94% hoạt tính khi... tăng, giảm của các điều kiện khảo sát so với điều kiện nuôi cấy được lựa chọn) ∆p = X 100% : đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch từ môi trường nuôi cấy khảo sát : đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch từ môi trường nuôi cấy lựa chọn 22 Chương 3 THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát thời điểm thu enzym từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto B subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài B subtilis. .. subtilis natto  Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện tốc độ lắc (100v/p và 150v/p) tới hoạt độ enzym ngoại bào của vi sinh vật  Sơ bộ thử khả năng phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng Pha môi trường thạch thường (theo phần 2.1.3), đun cho đồng nhất Chia đều môi trường vào trong... [16] Mỗi vi sinh vật đều có một nhiệt độ tối thiểu, tối thích và tối đa mà chúng có thể chịu được Khi nhiệt độ quá cao thì vi sinh vật sẽ chết, enzym bị biến tính, màng tế bào bị tổn thương tới mức khó phục hồi Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng sinh chất bị đông kết lại, enzym cũng ngừng hoạt động [7], [62] b) Ảnh hưởng của thời gian lên men Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được... hợp nattokinase [4], [34] Khi bổ sung maltose vào môi trường cũng làm tăng khả năng sinh α-amylase của B subtilis [40] e) Ảnh hưởng của pH pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật, đó là do sự tác dụng trực tiếp của ion H+ hoặc ion OH- đến tính chất keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym [2] Việc lựa chọn pH môi trường thu enzym phụ thuộc vào chủng... trường [7] Enzym VSV thường được sinh vào pha log (pha lũy thừa) Protease ngoại bào của loài B subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử [7], [41] c) Ảnh hưởng của tốc độ lắc Lượng oxy ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất và tích lũy các sản phẩm sinh tổng hợp của vi sinh vật Ví dụ khi nuôi cấy nấm men . subtilis natto 26 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B. subtilis natto 26 3.2.2. Kháo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh. 3.1. Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto 22 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym ngoại bào của B. subtilis. DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THÙY DƯƠNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ