BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAM CHANDARA KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAM CHANDARA KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo DS. Lê Ngọc Khánh, người đã luôn động viên, hướng dẫn tôi trong thời gian làm khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Đàm Thanh Xuân cùng toàn thể các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công Nghiệp Dược đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2013 Sinh viên MAM CHANDARA 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 6 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 7 1.1.Vi khuẩn Bacillus…………………………………………………………… 7 1.1.1. Giới thiệu về chi Bacillus ……………………………………………7 1.1.2. Vị trí phân loại………………………………………………………….7 1.1.3. Đặc điểm vi khuản Bacillus…………………………………………………7 1.1.4. Bào tử và khả năng hình thành bào tử……………………………… 8 1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus…………………………………… 10 1.2. Giới thiệu về Bacillus clausii………………………………………….11 1.2.1. Đặc điểm sinh thái sinh lý của Bacillus clausii………………………11 1.2.2. Ứng dụng của Bacillus clausii………………………………………14 1.3. Các phương pháp nuôi cấy……………………………………………16 CHƯƠNG 2: : NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị………………………….…… ………17 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất……………………………………………… 17 2.1.2. Máy móc, thiết bị………….………….………………….… ……… 17 2.1.3. Môi trường sử dụng………………………………………………… 17 2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………… …….18 2.2.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii……………18 3 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh khối………….18 2.3. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………… 18 2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina……………………18 2.3.2. Giữ giống trên thạch nghiêng…………………………………… 18 2.3.3. Chuẩn bị dịch nhân giống………………………………………….19 2.3.4. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng xác định lượng sinh khối ướt trong dịch lên men của Bacillus clausii tại thời điểm khác nhau ………………………………………………………………………19 2.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên khả năng tăng sinh khối ………………………………………………………19 2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối ……………………………………………………….20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 21 3.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii……………21 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis…………………………………………………………………….23 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis……………… 23 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối của Bacillus clausii …………………………………………………………….28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………… ……………………….32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 4 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu. Bảng 2.2. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu. Bảng 3.1. Lượng sinh khối thu được của Bacillus clausii tại các thời điểm khác nhau. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của Bacillus clausii ở nhiệt độ 37 0 C. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của Bacillus subtilis ở nhiệt độ 37 0 C. Bảng 3.4. So sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37 0 C. Bảng 3.5. Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ 30 0 C và 37 0 C của Bacillus clausii. Bảng 3.6. Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ 30 0 C và 37 0 C của Bacillus subtilis. Bảng 3.7. So sánh khả năng tăng sinh khối ở nhiệt độ 30 0 C và 37 0 C của Bacillus clausii và Bacillus subtilis. Trang 17 17 21 24 25 27 29 30 31 5 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bào tử Bacillus subtilis. Hình 1.2. Bào tử Bacillus anthracis. Hình 1.3. Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii. Hình 1.4. Cấu tạo bào tử. Hình 1.5. Bacillus clausii trên môi trường đặc. Hình 1.6. Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử. Hình 1.7. Chế phẩm Enterogermina. Hình 1.8. Chế phẩm Erceflora. Hình 1.9. Chế phẩm Bazivic. Hình 3.1. Sơ đồ biểu diễn đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii. Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus clausii theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37 0 C. Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus subtilis theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37 0 C. Hình 3.4. Đồ thị so sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37 0 C. Hình 3.5. Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus clausii ở nhiệt độ 30 0 C và 37 0 C. Hình 3.6. Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus subtilis ở nhiệt độ 30 0 C và 37 0 C. Trang 8 8 9 9 13 13 15 15 15 22 24 26 27 29 30 6 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong đường ruột của con người có sự hiện diện rất lớn của hệ vi sinh vật với khoảng hơn 100 tỷ vi khuẩn, bao gồm cả vi sinh vật có lợi và vi sinh vật có hại. Các vi sinh vật có lợi sẽ có tác động tốt cho sức khỏe như tổng hợp vitamin, giảm sự hình thành các chất gây hại trong ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giúp hấp thu tốt hơn và cải thiện sự rối loạn của đường ruột, cũng như tăng cường sức khỏe, giúp phòng bệnh. Ngược lại, các vi sinh vật gây hại sẽ gây ra những tác động xấu cho cơ thể như hình thành các chất gây hoại tử ruột, các chất gây ung thư, tiêu chảy… Trong cuộc sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường ruột dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài như lão hóa, dùng kháng sinh, thức ăn không vệ sinh… làm mất cân bằng về số lượng giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại, gây nên các bệnh đường ruột trong đó tiêu chảy là một điển hình. Vì vậy việc duy trì lượng vi sinh vật có lợi chiếm ưu thế nhằm hỗ trợ các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch ở đường ruột là rất quan trọng. Sử dụng chế phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Probiotic) nhằm mục đích bổ sung, cân bằng lại vi sinh vật đường ruột là một trong các phương pháp phòng và chữa bệnh tiêu chảy. Trong các Probiotic thì chế phẩm Enterogermina thực sự nổi bật, là chế phẩm duy nhất chứa bào tử Bacillus clausii kháng đa kháng sinh, và do sử dụng dạng bào tử nên vi khuẩn qua dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả. Tuy nhiên việc nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Bacillus clausii còn ít được quan tâm. Vì vậy, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh khối dưới dạng bào tử của vi khuẩn Bacillus clausii” được thực hiện nhằm giải quyết mục tiêu: - Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii - Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vi khuẩn Bacillus 1.1.1. Giới thiệu về chi Bacillus  Từ Bacillus theo tiếng Latinh có nghĩa là hình que, do đó Bacillus còn được gọi là trực khuẩn. Chi Bacillus gồm rất nhiều loài đã được biết đến như: Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus globigii, Bacillus natto, Bacillus clausii [15].  Do sự đa dạng về loài trong chi Bacillus, trực khuẩn có thể sống và được phân lập trong các môi trường khác nhau, từ đất, nước, không khí, côn trùng và con người. 1.1.2. Vị trí phân loại  Theo như Bergey’s manual of Systematic of Bacteriology 2 nd edition, 2004 thì chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae là một trong 4 họ thuộc bộ Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes trong giới vi khuẩn.  Việc phân loại vi khuẩn theo hình thái và sinh lý được hoàn thiện bằng việc giải trình tự gen 16S r.ARN. Theo phương pháp này người ta thấy Bacillus có mối quan hệ họ hàng với một số loại vi khuẩn không hình thành nội bài tử như Enterococcus, Lactobacillus và Streptococcus ở cấp phân loại bộ và có mối quan hệ với Literia và Staphylococcus ở cấp phân loại họ.  Chi Bacillus bao gồm trên 400 loài (476 loài). 1.1.3. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus  Vi khuẩn Bacillus có hình que, thường là Gram dương, có khả năng di động, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron trong quá trình trao đổi chất. 8  Về dinh dưỡng và sinh trưởng, Bacillus có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản như các loại đường, acid amin và các acid hữu cơ. Trong một số trường hợp chúng lên men cacbohydrat qua một loạt các chuỗi phản ứng phức tạp tạo ra glycerol và các glutadiol.  Phần lớn Bacillus sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30- 45ºC, pH khác nhau, dao động từ 2-11.  Khả năng hình thành bào tử là một trong những đặc điểm quan trọng của chi Bacillus. 1.1.4. Bào tử và khả năng hình thành bào tử  Bào tử (nội bào tử) của chi Bacillus được miêu tả lần đầu năm 1872 bởi Ferdinand Cohn khi nghiên cứu Bacillus subtilis và sau này của Koch khi nghiên cứu mầm bệnh than do vi khuẩn Bacillus anthracis năm 1976 [12]. Hình 1.1. Bào tử Bacillus subtilis Hình 1.2. Bào tử Bacillus anthracis Bào tử thường có dạng hình cầu hoặc elip, kích thước 0,8 - 1,4 µm chiều dài, là thể nghỉ của vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng khi điều kiện sống không thuận lợi. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử lại nảy mầm phát triển thành tế bào sinh dưỡng.  Sự hình thành nội bào tử qua các bước: - Trong tế bào sinh dưỡng ADN được phân chia thành nhiễm sắc thể (chromosom) riêng biệt và màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào. [...]... của Bacillus clausii 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis 2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis 2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis... trường dinh dưỡng và thu n tiện cho việc lấy mẫu nghiên cứu, thời điểm 24h được lựa chọn để thu sinh khối cho các thí nghiệm tiếp theo 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis... lượng sinh khối của Bacillus clausii Lựa chọn được tốc độ lắc 150 vòng/phút là tốc độ để thu được sinh khối với lượng sinh khối tương đương lượng sinh khối ở 200 vòng/phút và cao hơn so với khi lắc ở 100 vòng/phút - Khảo sát được nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh khối Lựa chọn nhiệt độ 300C là nhiệt độ để thu được sinh khối tốt nhất của Bacillus clausii 2 Kiên nghị: - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các điều. .. trưởng của Bacillus clausii từ 16h đến 96h Lượng sinh khối thu được lớn nhất là 1,10g tại thời điểm 40h, tuy nhiên chênh lệch so với 24h là không nhiều Để tiết kiệm thời gian và dinh dưỡng, đã lựa chọn được thời điểm để thu sinh khối cho các thí nghiệm là 24h  Khảo sát được ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ đến sinh khối của Bacillus clausii: - Khảo sát được ảnh hưởng của các tốc độ lắc... - Bào tử và khả năng tạo bào tử Trong điều kiện không thu n lợi, Bacillus clausii hình thành nội bào tử (endospore) theo cơ chế và cấu trúc bào tử gồm nhiều lớp vỏ bọc bền vững giống như các Bacillus khác Bào tử của Bacillus clausii có dạng hình cầu, kích thước 1,01±0,13 x 0,57± 0,05 μm [12] Hình 1.6 Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử 14 1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii Bacillus clausii. .. khối của Bacillus subtilis thu được sau khi nuôi cấy 24h với tốc độ lắc 150 vòng/phút tại nhiệt độ 300C cao hơn 28,3% so với ở 370C Kết quả này tương tự với kết quả của Bacillus clausii - So sánh khả năng tăng sinh khối ở tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C và 370C của Bacillus clausii và Bacillus subtilis Bảng 3.7 So sánh khả năng tăng sinh khối ở nhiệt độ 300C và 370C của Bacillus clausii và Bacillus. .. subtilis Vi sinh vật Lượng sinh khối (g) 300C 370C Bacillus clausii 0,84 0,76 Bacillus subtilis 0,95 0,74 Chênh lệnh lượng sinh khối 13,10 2,70 giữa 2 chủng VSV (%) Theo hình bảng 3.7, ta thấy ở nhiệt độ 370C thì lượng sinh khối thu được của Bacillus clausii và Bacillus subtilis tương đương nhau (chênh lệch 2,7%) và đều ít hơn lượng sinh khối ở 300C Ở nhiệt độ 300C thì lượng sinh khối của Bacillus clausii. .. màng tế bào chất, thành bào tử (nha bào) được hình thành và một phần vỏ cũng được hoàn thành - Vỏ bào tử được hình thành đầy đủ bao quanh ADN - Bào tử chín và được giải phóng ra ngoài tế bào [1] Tế bào sinh dưỡng Bào tử tự do Áo bào tử Sự phát triển Tế bào mẹ của áo bào Hình 1.3 Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii  Quá trình hình thành bào tử rất phức tạp, mất khoảng 6-8 giờ, để có thể... việc khảo sát điều kiện để thu được lượng bào tử lớn nhất được đưa về khảo sát điều kiện để thu được lượng sinh 23 khối lớn nhất Đối chiếu với kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, lượng sinh khối thu được tại thời điểm 40h là nhiều nhất, sau 40h một lượng sinh khối đã chuyển thành dạng bào tử Khi so sánh với lượng sinh khối thu được tại thời điểm 24h, sự chênh lệch này là không quá lớn (12%) Chính vì vậy, để. .. ra bào tử có cấu trúc vững bền chịu được hoàn cảnh khắc nghiệt  Đặc điểm bào tử vi khuẩn: Vỏ bào tử Thành tế bào Áo trong bào tử Màng tế bào Lõi Áo ngoài bào tử Màng ngoài Hình 1.4 Cấu tạo bào tử - Cấu trúc bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN, các lớp bao bọc (gồm màng bào tử, thành bào tử, vỏ bào tử, áo bào tử gồm 2 lớp áo trong và áo ngoài) chiếm tới 50% thể tích bào . dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii - Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis. dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis. QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 21 3.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii …………21 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus