Định tính saponin trong dược liệu giảo cổ lam bằng HPLC

56 823 5
Định tính saponin trong dược liệu giảo cổ lam bằng HPLC

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ nhiên ngày càng tăng. Con người có khuynh hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên do hiệu quả điều trị cũng như ít tác dụng phụ hơn thuốc tân dược. Việt Nam chúng ta cũng không nằm ngoài xu hướng đó. Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước ta có hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc. Đất đai và khí hậu nhiệt đới gió mùa phù hợp với nhiều loài cây trồng, trong đó có nhiều loài cây thuốc quý. Đây chính là tiền đề tốt để ngành Dược phát triển thuốc từ dược liệu. Diếp cá là loài thực vật phổ biến ở Việt Nam. Diếp cá không chỉ được sử dụng làm rau ăn hàng ngày mà còn được sử dụng làm thuốc với nhiều công dụng như: trị mụn nhọt, trĩ, viêm ruột, lở ngứa…6. Các thành phần đã được nghiên cứu xác định trong diếp cá như: flavonoid 24, tinh dầu 15, alkaloid 16 trong đó flavonoid là thành phần chính có nhiều tác dụng: chống viêm, phòng chống ung thư, chống oxy hóa 12…Do đó có thể thấy công dụng điều trị của cao diếp cá do các hợp chất flavonoid. Hiện nay diếp cá được nhiều Công ty dược phẩm trong nước quan tâm nghiên cứu, sản xuất thành các sản phẩm lưu hành trên thị trường như An trĩ vương, Herlaf…với thành phần chính là cao diếp cá. Tiến hành nghiên cứu quy trình chiết xuất sẽ giúp xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu nhằm thu được cao diếp cá giàu flavonoid, góp phần đảm bảo chất lượng cao thuốc khi đưa vào sản xuất. Ngoài ra, trước khi đưa vào sản xuất cần phải đánh giá chất lượng cao diếp cá, do đó đó việc xây dựng tiêu chuẩn cao thuốc rất có ý nghĩa trong việc kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu đầu vào này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm Diếp cá” với các mục tiêu sau: Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao bán thành phẩm diếp cá giàu flavonoid. Tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm diếp cá giàu flavonoid.

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược Liệu 2. Bộ môn Vật Lý – Hóa Lý HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Khóa luận “Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu và bộ môn Vật Lý - Hóa Lý trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn. Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anh người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn DS Lê Xuân Kỳ, DS Đào Văn Nam đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tại bộ môn Vật Lý- Hóa Lý. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, bộ môn Vật Lý - Hóa Lý đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Bích Ngọc MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 3 1.1 TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU GIẢO CÔ LAM. 3 1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố của chi Gynostemma Blume. 3 1.1.2 Thành phần hóa học của G. pentaphyllum 3 1.1.3 Tác dụng dược lý 5 1.1.4 Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng. 7 1.2 PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƢỢC LIỆU …………………………………… 8 1.2.1 Phương pháp HPLC 8 1.2.2 Ứng dụng của HPLC trong phân tích Dược liệu và các hợp chất tự nhiên 10 1.3 PHƢƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU 11 1.4 DẤU VÂN TAY TRONG HPLC VÀ XU HƢỚNG ĐỊNH TÍNH DƢỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC 13 1.4.1 Phương pháp dấu vân tay trong HPLC 13 1.4.2 Xu hướng định tính dược liệu và chế phẩm đông dược. 14 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 16 2.1.3 Hóa chất 16 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ DL. 17 2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 20 2.3.3 Thẩm định phương pháp 21 2.3.4 Phân tích định tính saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng HPLC 22 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 23 3.1 CHIẾT XUẤT - TINH CHẾ SAPONIN TOÀN PHẦN TỪ DL 23 3.1.1 Chiết xuất. 23 3.1.2 Tinh chế 23 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 25 3.2.1 Khảo sát bước sóng 25 3.2.2 Khảo sát hệ dung môi 25 3.2.3 Khảo sát thể tích bơm mẫu 26 3.2.4 Khảo sát tốc độ dòng 27 3.2.5 Đánh giá chuẩn nội Rb1 28 3.3 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 29 3.3.1 Tính phù hợp của hệ thống 29 3.3.2 Độ ổn định 30 3.3.3 Độ lặp lại 31 3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC MẪU GCL THU HÁI TẠI ĐÀ LẠT 31 3.5 BÀN LUẬN 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 PHỤ LỤC 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MeOH Methanol EtOH Ethanol ACN Acetonitril HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) G. Gynostemma GCL Giảo cổ lam RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SKLM Sắc kí lớp mỏng STT Số thứ tự SKLM Sắc kí lớp mỏng UV – VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) V Thể tích TB Trung bình DL Dược liệu DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic 4 2 Hình 1.2 Sơ đồ máy HPLC 8 3 Hình 3.1 Sắc ký đồ của dung dịch trước và sau khi qua cột nhựa Diaion HP-20 24 4 Hình 3.2 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử 24 5 Hình 3.3 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn Ginsenoside Rb1 trên máy HPLC 25 6 Hình 3.4 Sắc ký đồ của các saponin trong GCL (khảo sát điều kiện sắc ký) 28 7 Hình 3.5 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Rb1 28 8 Hình 3.6 Sắc ký đồ của 5 mẫu GCL thu hái tại Đà Lạt 32 9 Hình 3.7 Bốn tiểu vùng saponin trong GCL bằng phương pháp dấu vân tay trong HPLC 35 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi rửa giải 23 2 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 29 3 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ ổn định của quy trình phân tích 30 4 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích 31 5 Bảng 3.5 Khoảng tin cậy (95%) của 5 mầu GCL thu hái tại Đà Lạt 33 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh. Năm 1997, GS. TS. Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam. Thành phần hóa học chính của Giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại đường [2], [5]. Các đặc tính dược lý của Giảo cổ lam hầu hết đều thuộc về saponin, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc [36]. GCL được biết đến với rất nhiều tác dụng quý như tác dụng hạ lipid [20], [39], hạ đường huyết [36], ức chế khối u [21], [36], tác dụng tốt trên tim mạch và hệ thần kinh [12], [36]…Do vậy, GCL hỗ trợ tốt trong các trường hợp mỡ máu cao, huyết áp cao, đái tháo đường tuýp II… Tuy nhiên, nguồn gốc và thành phần hóa học của GCL khá phức tạp. Saponin trong GCL khác nhau giữa các loài và vùng trồng, thay đổi theo điều kiện thời tiết khí hậu [18]. Hơn nữa, hiện chưa xác định được saponin có tác dụng dược lý đặc trưng do vậy việc kiểm soát chất lượng của dược liệu gặp nhiều khó khăn. Các loại kỹ thuật dấu vân tay - Fingerprint đã dần dần đi vào thực tế bằng việc xây dựng mô hình sắc ký của các thành phần có hoạt tính dược lý và các đặc tính hóa học của thảo dược. Phương pháp này góp phần xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất và ổn định, giúp kiểm soát chất lượng thảo dược và các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược. Đây là một xu hướng trong định tính dược liệu và các chế phẩm đông dược. Nhằm hoàn thiện tiêu chuẩn dược liệu Giảo cổ lam, giúp lựa chọn nguồn nguyên liệu ổn định và chất lượng, khóa luận “Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC” đươc thực hiện với 2 mục tiêu sau: 2 1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu Giảo cổ lam. 2. Định tính thành phần saponin của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng phương pháp dấu vân tay - Fingerprint trong HPLC. [...]... VÂN TAY TRONG HPLC VÀ XU HƢỚNG ĐỊNH TÍNH DƢỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC 1.4.1 Phƣơng pháp dấu vân tay trong HPLC  Định nghĩa: Dấu vân tay sắc ký của thảo dược và các loại thuốc thảo dược là mô hình sắc ký của các thành phần có hoạt tính dược lý và các đặc tính hóa học trong chiết xuất [24] 14  Đặc điểm: - Phương pháp phổ biến nhất trong nhiều phòng thí nghiệm là HPLC- UV và HPLC- DAD (70%), HPLC- MS... chạy máy HPLC: Acetonnitril, Methanol, Nước… 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế phân đoạn saponin toàn phần từ dược liệu Giảo cổ lam - Khảo sát các điều kiện để định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng phương pháp HPLC: Bước sóng, hệ dung môi, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu - Thẩm định lại phương pháp vừa xây dựng: Độ phù hợp của hệ thống, độ lặp lại, độ ổn định - Từ... tế, điều chỉnh hệ dung môi để tách các pic saponin tốt hơn như sau: Khoảng thời gian (phút) Nồng độ % của ACN 0 25 0-29 47 29-50 47 50-53 80 53-56 25 Nhận xét: Sắc ký với chương trình chạy như trên có khả năng tách được các saponin trong Giảo cổ lam nên đây sẽ là chương trình dung môi được lựa chọn để sử dụng trong định tính các saponin trong dược liệu Giảo cổ lam 3.2.3 Khảo sát thể tích bơm mẫu Tiến... Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành định tính saponin trong một số mẫu Giảo cổ lam của loài G pentaphyllum 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dƣợc liệu a) Chiết xuất Trịnh Thị Diệp Thanh, khóa luận tốt nghiệp dược sỹ năm 2013 đã tiến hành khảo sát quy trình chiết xuất dược liệu chứa saponin trong GCL với 3 phương pháp: chiết soxhlet,... lưu thông rộng rãi trên thị trường như Giảo cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Thiên Bảo, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ lam Tam Đảo…Các sản phẩm từ GCL cũng xuất hiện trên thị trường Nhật Bản, Trung Quốc và Thái Lan 8 1.2 PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƢỢC LIỆU 1.2.1 Phƣơng pháp HPLC  Nguyên tắc: HPLC là 1 kỹ thuật tách trong đó các chất di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển... dược khác nhau [18] 1.4.2 Xu hƣớng định tính dƣợc liệu và chế phẩm đông dƣợc - Xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất của thuốc thảo dược và các sản phẩm liên quan của thảo dược đó [24] - Phân tích các dẫn xuất có tác dụng dược lý và sinh học đặc trưng theo các nguồn gốc địa lý khác nhau [38] - Theo dõi sự ổn định thể hiện qua sự già hóa của dược liệu và các chế phẩm của dược liệu. .. tích vết vân tay sắc ký khí và HPLC , dược điển Hồng Kông [22] 23 CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 3.1 CHIẾT XUẤT - TINH CHẾ SAPONIN TOÀN PHẦN TỪ DƢỢC LIỆU 3.1.1 Chiết xuất Chiết 1 g dược liệu Giảo cổ lam bằng phương pháp chiết siêu âm với EtOH 70% (3 lần x 20ml/ lần, thời gian 10 phút, công suất 40%) Gộp dịch chiết, lọc qua bông và giấy lọc Cô cách thủy đến cắn, hòa tan trong 3 ml nước cất thu được dung... Tiến hành phân tích 6 phép thử song song (Xử lý mẫu, sắc ký) của cùng 1 mẫu 22 Xác định RSD của các đỉnh đặc trưng với thông số thời gian lưu tương đối RRT Yêu cầu: Chênh lệch giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2 % [4], [22] 2.3.4 Phân tích định tính saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng HPLC - Phân tích các mẫu GCL của loài G pentaphyllum thu hái tại Đà Lạt (5 mẫu) STT... có saponin, flavonoid và các loại đường 4 - Saponin Nhiều nghiên cứu đã phát hiện saponin có mặt trong GCL thuộc nhóm dammaran [29] Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic) Trong phân tử có 30C và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax, họ Araliaceae Đặc biệt saponin trong. .. dung tích 50ml - Thấm ẩm dược liệu bằng dung môi EtOH 70% rồi thêm dung môi ngập dược liệu - Tiến hành chiết siêu âm trong thời gian 10 phút, công suất 40% Thu lấy dịch chiết - Tiếp tục thêm dung môi ngập dược liệu và chiết thêm 2 lần đến khi dịch chiết trong Tổng lượng dịch sử dụng khoảng 60ml - Gộp dịch chiết thu được đem lọc hai lần qua bông và giấy lọc Tiến hành cô cách thủy trong tủ hút đến khi thu . luận Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC đươc thực hiện với 2 mục tiêu sau: 2 1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu Giảo cổ lam. . gốc từ thảo dược. Đây là một xu hướng trong định tính dược liệu và các chế phẩm đông dược. Nhằm hoàn thiện tiêu chuẩn dược liệu Giảo cổ lam, giúp lựa chọn nguồn nguyên liệu ổn định và chất. LỜI CẢM ƠN Khóa luận Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu và bộ môn Vật Lý - Hóa Lý trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc

Ngày đăng: 28/07/2015, 18:14

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan