1 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HƯƠNG GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183.219 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 2 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HƯƠNG GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183.219 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 3 Lời cảm ơn Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Cao Văn Thu – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh – Sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy, cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Vì điều kiện hạn hẹp về thời gian, về phương tiện nghiên cứu và trình độ của bản thân, chắc chắn khóa luận còn có nhiều thiếu sót, hạn chế. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Trần Thị Hương 4 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………… …………………………………… 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN……………… ………………………………… 2 1.1 Đại cương về kháng sinh……………… ……………………………… 2 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ……………… ……………………………… 2 1.1.2 Phân loại kháng sinh…………………… …………………………… 2 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh…………… ………………………… 2 1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh……………… …………………… 3 1.2. Đại cương về xạ khuẩn……… …………… ……………………… 4 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn…………… ……………………… 4 1.2.2. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces……… ………… 5 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn……… … 6 1.3.1. Mục đích……………………… …………………………… …… 6 1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên…… …… 7 1.3.3. Đột biến cải tạo giống……………………………………… … 7 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 8 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh…………………………… … 8 1.4.1. Khái niệm lên men………………… ……………………… 8 1.4.2. Các phương pháp lên men…………………… …………… 8 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men…… ……… … 9 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men………… 9 1.5.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh…………………… 9 1.5.2 Các phương pháp chiết tách ………………………………… 10 1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh………………… 10 1.6.1 Phổ tử ngoại - khả kiến …………………………………… 10 1.6.2 Phổ hồng ngoại……………………………………………… 11 1.6.3 Phương pháp phổ khối………………………….……… 11 1.7. Sản xuất actynomycin D nhờ Streptomyces sindenensis mới được phân lập 12 5 1.8. Ảnh hưởng của các mức độ oxy hòa tan lên pellet sản xuất Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị……… ……………………… 14 2.1.1. Nguyên vật liệu…………………….……………………… 14 2.1.2. Máy móc thiết bị……………………… ……………… 17 2.2 . Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống 18 2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 18 2.2.3. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.219 19 2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 19 2.3. Phương pháp thực nghiệm 19 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 19 2.3.2. Phân loại xạ khuẩn theo ISP 19 2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 20 2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 21 2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên 22 2.3.6. Đột biến bằng ánh sáng UV 22 2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.8. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 24 2.3.9. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 24 2.3.10. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24 2.2.11. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 25 2.3.12. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 25 2.3.13. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 26 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 27 3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.219 27 6 3.2. Phổ tác dụng của kháng sinh do Streptomyces 183.219 sinh tổng hợp 28 3.3. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 28 3.4. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 29 3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 30 3.6. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 31 3.7. Kết quả chọn môi trường lên men chìm 32 3.8. Kết quả chọn chủng lên men 33 3.9. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt 33 3.10. Kết quả chọn dung môi và pH chiết 34 3.11. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 35 3.12. Kết quả sắc ký cột 36 3.13. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết… 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39,40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 7 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AND Acid 2’- deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ĐB1 Đột biến lần 1 ĐB2 Đột biến lần 2 G(+) Gram dương G(-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project ( Chương trình Streptomyces quốc tế ) KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể MT2dt Môi trường 2 dịch thể S. flexneri Shigella flexneri B. pumilus Bacillus pumilus SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên VSV Vi sinh vật Vđ Vừa đủ 8 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định 14 2 Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn 14 3 Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định 15 4 Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng 17 5 Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.219 và Streptomyces gougeroti 27 6 Bảng 3.2: HTKS của Streptomyces 183.219 trên một số VSV kiểm định 28 7 Bảng 3.3: HTKS của Streptomyces 183.219 trên MT1, MT2, MT5 28 8 Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 29 9 Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 30 10 Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 31 11 Bảng 3.7: Kết quả chọn môi trường lên men chìm 33 12 Bảng 3.8: Kết quả chọn chủng lên men 33 13 Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền pH 34 14 Bảng 3.10: Kết quả thử độ bền nhiệt 34 15 Bảng 3.11: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên S. flexneri) 35 16 Bảng 3.12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 35 17 Bảng 3.13: Kết quả chạy sắc ký cột 36 18 Bảng 3.14: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột (trên S. flexneri) 37 19 Bảng 3.15: Kết quả chạy sắc ký cột 37 20 Bảng 3.16: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột lần 2 (trên S. flexneri) 37 21 Bảng 3.17: Kết quả IR 38 9 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính 3 2 Hình 1.2: Khuẩn lạc xạ khuẩn 4 3 Hình 1.3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 5 4 Hình 1.4: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn 6 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ khi ra đời cho đến nay, kháng sinh là một vũ khí quan trọng để chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên với tình hình sử dụng kháng sinh không kiểm soát như hiện nay đã dẫn tới một loạt các hệ quả mà con người đang phải vất vả khắc phục nó. Các hệ quả có thể thấy ngay đó là tình trạng kháng kháng sinh xuất hiện và ngày càng trở nên nghiêm trọng. Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới là điều hết sức cần thiết và luôn được cả thế giới quan tâm. Bên cạnh đó, Việt Nam là nước đang phát triển nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tỷ lệ kháng kháng sinh thuộc hàng cao nhất thế giới (WHO). Mặt khác cũng chính khí hậu đó là một điều kiện thuận lợi cho sự sinh sôi, phát triển của hệ vi sinh vật và cũng tạo môi trường tốt cho khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chi xạ khuẩn Streptomyces. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp từ Streptomyces 183.219” để làm khóa luận tốt nghiệp. Trong khuôn khổ khóa luận này, tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: - Phân loại theo ISP để xác định tên khoa học của Streptomyces 183.219, - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, - Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất, - Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được. [...]... tinh thể kháng sinh vào ống nghiệm sạch Sau đó, bột tinh thể kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C để thu kháng sinh tinh khiết 2.3.13 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, tử ngoại để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được 27 CHƯƠNG... khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất 19 - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ 2.2.3 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183. 219 - Xác định các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183. 219 - So sánh với đặc điểm phân loại ISP của một số chủng Streptomyces để xác định tên khoa học của Streptomyces 183. 219 2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được - Xác định... tác dụng của các họ kháng sinh chính 1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh [14] - Trong lĩnh vực y học: kháng sinh được sử dụng để điều trị các bệnh do vi khuẩn, nấm gây ra Ngoài ra một số kháng sinh còn được dùng trong điều trị ung thư - Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được 4 sử dụng như chất...2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh [5,6,14,21] Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp 1.1.2 Phân loại kháng sinh [5,12,14]... loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác Phân loại kháng. .. các tính trạng dẫn đến làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh (đột biến dương) Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu tính, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần 8 1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn... sindenensisn MTCC 8122 tổng hợp kháng sinh chống ung thư actinomycin-D Hầu hết actinomycin D được sản xuất từ Streptomyces parvulus Sản xuất kháng sinh phụ thuộc vào thông khí và tốc độ khuấy trộn của quá trình lên men Khi MT đạt đến độ thông khí ở 1,5 vvm và tốc độ khuấy trộn đạt 600 rpm, pH 7-8, sản lượng kháng sinh đạt được lớn nhất là 120 g/l, cao hơn khoảng 50% sản lượng đạt được đạt được so với khi... khác Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm chất sau đây: - Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin) - Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol) - Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) - Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin) - Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) - Các kháng sinh macrolid (erythromycin,... có HTKS cao nhất - Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch... triệu xạ khuẩn Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều Trong số hơn 16 000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase, . cho khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chi xạ khuẩn Streptomyces. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: Góp phần nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp từ Streptomyces 183. 219” để. GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183. 219 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh. BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HƯƠNG GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183. 219 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014