NGUYỄN THỊ KIM VUI GÓP PHẦN STREPTOMYCES 168.27 - 2013 BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ KIM VUI GÓP PHẦN STREPTOMYCES 168.27 : ThS. Nguyễn Liên Hương : - 2013 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành tại bộ môn Vi sinh & Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội. , động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện khóa luận này. - - . . . . ! 5 năm 2013. Sinh viên NGUYỄN THỊ KIM VUI MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cƣơng về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2 1.1.3. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh 2 1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh 3 1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn(Actinomycetes) 3 1.2.1. Đại cương về xạ khuẩn 3 1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 4 1.3. Sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. 5 1.3.1. Sự hình thành các chất kháng sinh ở xạ khuẩn 5 1.3.2. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 5 1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 6 1.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 7 1.4.1. Mục đích 7 1.4.2. Sàng lọc ngẫu nhiên 7 1.4.3. Đột biến cải tạo giống 8 1.4.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 9 1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9 1.5.1. Khái niệm lên men 9 1.5.2. Các phương pháp lên men 10 1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10 1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 11 1.6.1. Chiết xuất 11 1.6.2. Tách, tinh chế sản phẩm: 11 1.7. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12 1.7.1. Phổ tử ngoại 12 1.7.2. Phổ hồng ngoại 13 1.7.3. Khối phổ (MS) 13 1.8. Các nghiên cứu liên quan: 13 1.8.1. Điều chỉnh sinh tổng hợp daunorubicin từ S.peucetius –phản hồi và dự tính kiểm soát phiên mã 13 1.8.2. Sự xuất hiện và sinh tổng hợp C-demethylactinomycin (C-DMA) từ S.chrysomallus và S.parvulus sinh actinomycin 14 1.8.3. Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của actinomycete phân lập từ chất lắng ở biển 15 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 16 2.1.1. Nguyên vật liệu 16 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm 18 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 18 2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 18 2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên 20 2.3.4. Đột biến 20 2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21 2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 22 2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 22 2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 23 2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 24 2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 24 2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 24 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 25 3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 25 3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 26 3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 27 3.4. Kết quả đột biến hóa học 28 3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30 3.6. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt của kháng sinh trong dịch lọc 31 3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết 32 3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 33 3.9. Kết quả sắc ký cột 34 3.9.1. Chạy cột sắc ký lần 1 34 3.9.2. Chạy cột sắc ký lần 2 36 3.9.3. Chạy cột sắc ký lần 3 39 3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ADN Acid 2’- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên CKS Chất kháng sinh DMHC Dung môi hữu cơ D (mm) Đường kính vòng vô khuẩn ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại- Infrared KH Khoa học KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P.mirabilis Proteus mirabilis s Độ lệch thực nghiệm hiệu chỉnh SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TĐC Trao đổi chất V Thể tích VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại- Ultraviolet Danh mục các bảng Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên chủng Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 Bảng3. 7: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học Bảng 3.8: Kết quả chọn môi trường lên men Bảng 3.9: Kết quả chọn biến chủng lên men chìm tốt nhất Bảng 3.10: Kết quả thử độ bền của dịch lọc ở các pH khác nhau Bảng 3.11: Kết quả thử độ bền nhiệt của kháng sinh Bảng 3.12: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (P.mirabilis) Bảng 3.13: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký Bảng 3.14: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột (P.mirabilis) Bảng 3.16: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2- nhóm 1 (2-8) Bảng 3.17: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột phân nhóm 1.1 (P.mirabilis) Bảng 3.18: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2- nhóm 3 (15-18) Bảng 3.19: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột phân nhóm 3.2 (P.mirabilis) Bảng 3.20: Kết quả SKLM sau chạy cột lần 3 (P.mirabilis) Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn. Hình 1.2: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh Hình 1.3: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn Hình 3.4: Pic sắc ký cột lần 1 Hình 3.5: Pic sắc ký cột lần 2 (nhóm 1) Hình 3.6: Pic sắc ký cột lần 2 (nhóm 3) 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cách đây hơn 70 năm, Penicillin – kháng sinh đầu tiên ra đời có khả năng tiêu diệt vi khuẩn mạnh mẽ đã mở ra một tương lai lạc quan cho nhiều bệnh nhân nhiễm khuẩn. Nhưng đến nay cuộc chiến giữa kháng sinh và vi khuẩn vẫn tiếp diễn, nhiều loại vi khuẩn tưởng đã bị tiêu diệt từ lâu với kháng sinh chuyên trị nhưng giờ đây vẫn còn hiện diện và đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh. Điều hết sức đáng sợ trong những năm vừa qua là song song với việc phát hiện thêm các chủng vi khuẩn siêu kháng thuốc thì tốc độ tìm ra các loại kháng sinh mới lại không hề theo kịp tốc độ phát triển của các loại vi khuẩn. Với sự gia tăng số lượng các ca tử vong do vi khuẩn kháng thuốc và mối đe dọa của các loại “siêu vi khuẩn” có khả năng kháng lại hầu như mọi loại kháng sinh là một trong những vấn đề gây lo ngại và trở thành mối quan tâm nghiên cứu của những nhà khoa học. Phương pháp chủ yếu để tìm ra kháng sinh hiện nay vẫn là phương pháp sinh học- các kháng sinh mới có thể được tổng hợp rất phong phú từ vi khuẩn, xạ khuẩn hoặc nấm. Đặc biệt nước ta với môi trường tự nhiên rất đa dạng là điều kiện thuận lợi cho sự sinh sôi phát triển của hệ vi sinh trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó chi xạ khuẩn Streptomyces với khả năng tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm nhất. Chính vì thế chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 168.27” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 168.27. - Nghiên cứu điều kiện lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh từ dịch lọc, dịch lên men tối thích để thu kháng sinh tinh khiết. - Sơ bộ xác định một số đặc tính của kháng sinh đã thu được. 2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về kháng sinh 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là tất cả những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như cả với các tế bào ung thư) ở nồng độ thấp mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung [6, 18]. 1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Có 5 kiểu chủ yếu [3, 18] : • Ức chế tổng hợp vách tế bào VK làm VK bị tiêu diệt. Một số kháng sinh như: β- lactamase, vancomycin, bacitracin, fosfomycin tác dụng theo cơ chế này. • Tác động lên quá trình tổng hợp protein của VK: – Gắn vào tiểu đơn vị 30S có tác dụng kìm khuẩn: Cloramphenicol, tetracyclin, macrolid và lincosamid. – Gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom làm tiêu diệt VK: Các aminoglycosid, spectinomycin. • Ức chế tổng hợp acid nucleic từ quá trình sao chép và phiên mã: Actinomycin, antracyclin, rifampicin. • Thay đổi tính thấm của màng: Polymycin, amphotericin. • Kháng chuyển hóa: Co– trimoxazol (gồm sulfamethoxazol và trimethoprim). 1.1.3. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh Những yêu cầu của y học đối với một kháng sinh là [6]: • Kháng sinh phải không độc hoặc rất ít độc đối với cơ thể. • Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh và mạnh đối với VSV gây bệnh. • Dễ hòa tan trong nước và bền vững khi bảo quản lâu dài. [...]... Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh Dịch chiết đậm khối đặc Sản phẩm tinh Sản phẩm tinh chế chế Sản phẩm đã kiểm nghiệm Sản phẩm được đóng gói 1.2 1.3.3 Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Nhiệt độ: đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 -300C, nhưng nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng tổng. .. HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp Do đó, để đáp ứng yêu cầu của nhà sản xuất công nghiệp cần cải tạo giống VSV với mục đích khác nhau [17]: - Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt hơn… - Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn - Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới,... 2.2 Nội dung nghiên cứu Để thực hiện các mục tiêu, đề tài được tiến hành với các nội dung cụ thể như sau: – Tiến hành cải tạo giống theo các phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến nhân tạo sử dụng cả tác nhân vật lý và hóa học – Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh, khảo sát độ bền pH, độ bền nhiệt của hoạt chất Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế kháng sinh do Streptomyces 168.27 tổng hợp – Xác... trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor [12] 1.3.2 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được thể hiện trong hình 1.2 [6, 8] 6 Giống... không thể xử lý cục bộ nếu hỏng đợt lên men sẽ gây thất thu, tốn kém rất lớn [6, 7, 8] Có 4 kiểu lên men chìm như sau: + Lên men mẻ (lên men chu kỳ) + Lên men có bổ sung + Lên men liên tục + Lên men bán liên tục 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của... là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được rất nhiều các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu [10, 11] 4 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp [4] Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có... sinh vật lạ [17] Hiện nay có nhiều phương pháp để bảo quản các chủng VSV như: cấy chuyền, làm khô, đông khô, ổn định trong đất… Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [13, 17] 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Khái niệm lên men Lên men. .. tử của việc sinh tổng hợp ra nó sẽ góp phần tìm hiểu di truyền học của dãy để có hiệu suất cao hơn Thêm nữa, sự hiểu biết này có thể được áp dụng để thiết kế các kháng sinh lai có thế được thực hiện invivo nhờ chuyển các gene từ loài Streptomyces này sang loài khác [22] Sinh tổng hợp của daunorubicin ở S.peucetius được hoàn thành bởi chức năng của 30 gene mã hóa enzym theo một kiểu phối hợp chuỗi Ngoài... nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [8] 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị Do vậy cần lựa chọn các kỹ thuật chiết tách, tinh chế thích hợp để thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao và hoạt lực kháng sinh mạnh... 48h Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h 2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men • Mục đích: xác định khả năng chịu nhiệt của kháng . đề tài: Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 168. 27 làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9 1.5.1. Khái niệm lên men 9 1.5.2. Các phương pháp lên men 10 1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10 1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh. tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 168. 27. - Nghiên cứu điều kiện lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh từ dịch lọc, dịch lên men tối thích để thu kháng sinh tinh khiết. - Sơ bộ xác