BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGUYỆT MINH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 15.29 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGUYỆT MINH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 15.29 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 Lời cảm ơn Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Cao Văn Thu - người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu nghiên cứu khoa học đến khi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại Bộ môn Vi sinh-Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược và Viện hóa học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã khuyến khích, động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và làm khóa luận. Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn và kiến thức của bản thân còn hạn chế nên khóa luận này còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để khóa luận được chỉnh sửa và hoàn thiện hơn nữa. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2014. Sinh viên Nguyễn Nguyệt Minh Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh. 2 1.1.1. Định nghĩa về kháng sinh. 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh. 2 1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh. 3 1.1.4. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh. 3 1.2. Đại cương về xạ khuẩn. 5 1.2.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces. 5 1.2.2. Khả năng hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn. 7 1.2.3. Con đường hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn. 7 1.3. Phương pháp cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn. 8 1.3.1. Mục đích 8 1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống. 8 1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn. 9 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. 10 1.4.1. Bản chất của quá trình lên men 10 1.4.2. Giống vi sinh vật 10 1.4.3. Các phương pháp lên men. 10 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh 11 1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh. 11 1.5.2. Chiết xuất. 11 1.5.3. Tách sản phẩm. 12 1.6. Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh 12 1.6.1. Phổ tử ngoại (UV). 12 1.6.2. Phổ hồng ngoại (IR) 13 1.6.3. Phổ khối (MS) 13 1.7. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 - Streptomyces Microflavus. 14 1.8. Xây dựng và tối ưu hóa thống kê về môi trường nuôi cấy để nâng cao sự sản xuất hợp chất kháng khuẩn bởi Streptomyces sp. JAJ06. 14 1.9. Phân lập và nhận diện phân tử của Streptomyces spp. với hoạt tính kháng khuẩn từ vùng Tây Bắc của Iran. 15 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 17 2.1.1. Nguyên vật liệu 17 2.1.2. Máy móc, thiết bị. 19 2.2. Nội dung nghiên cứu. 20 2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống 20 2.2.2. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh. 20 2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được. 20 2.3. Phương pháp thực nghiệm. 20 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20 2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21 2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên 21 2.3.4. Đột biến 22 2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ. 24 2.3.7. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24 2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay. 25 2.3.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 25 2.3.10. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết. 25 2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh khiết thu được. 25 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 26 3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 26 3.2. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1. 26 3.3. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2. 28 3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29 3.4.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất. 29 3.4.2. Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất. 30 3.5. Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ. 31 3.6. Kết quả sắc ký cột. 32 3.6.1. Sắc ký cột lần 1. 32 3.6.2. Sắc ký cột lần 2. 34 3.6.3. Sắc ký cột lần 3. 36 3.6.4. Hiệu suất quá trình tách và tinh chế kháng sinh. 37 3.7. Kết quả sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được. 37 3.7.1. Chất tinh khiết 1. 37 3.7.2. Chất tinh khiết 2. 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic CW Cell wall (Thành tế bào) DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr Gram Gr (+) Gram dương Gr (-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Infrared (Hồng ngoại) L-DAP L-diaminopimelat acid MS Mass spectrometry (Phổ khối) MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P. mirabilis Proteus mirabilis RAPD Random amplified polymorphic DNA (ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên) S. aureus Staphylococcus aureus SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TK Tinh khiết UV Ultraviolet (Tử ngoại) VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Nội dung Bảng 1.1 Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học Bảng 1.2 Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định Bảng 2.2 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.3 Các môi trường dùng trong nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.4 Các dung môi đã sử dụng Bảng 3.1 Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.2 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1 Bảng 3.3 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2 Bảng 3.4 Kết quả chọn môi trường lên men. Bảng 3.5 Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt Bảng 3.6 Kết quả chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ Bảng 3.7 Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Bảng 3.8 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Bảng 3.9 Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2 Bảng 3.10 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 2 Bảng 3.11 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 3 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Tên hình Nội dung Hình 1.1 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Hình 3.1 Đồ thị kết quả thử HTKS các dạng chủng, biến chủng trong lên men chìm Phụ lục 1 Hình ảnh 3 bình nón chứa 3 môi trường lên men chìm lần 1 Phụ lục 2 Kết quả thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Phụ lục 3 Hình ảnh sắc ký cột lần 1 Phụ lục 4 Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên Phụ lục 5 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1 Phụ lục 6 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2. Phụ lục 7 Phổ UV của chất tinh khiết 1 Phụ lục 8 Phổ UV của chất tinh khiết 2 Phụ lục 9 Phổ IR chất tinh khiết 1 Phụ lục 10 Phổ IR chất tinh khiết 2 Phụ lục 11 Phổ khối chất tinh khiết 1 Phụ lục 12 Phổ khối chất tinh khiết 2 [...]... trung nghiên cứu Tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường đại học Dược Hà Nội, tôi chọn đề tài nghiên cứu: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 với các mục tiêu sau: + Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh + Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp của chủng Streptomyces 15.29, nghiên cứu chiết xuất, tinh chế kháng sinh do Streptomyces 15.29. .. hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn Các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp được thì có tới 60% là từ Streptomyces Bảng 1.2 giới thiệu một số kháng sinh do Streptomyces tổng hợp [6], [10] Bảng 1.2: Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp Kháng sinh Chủng sinh tổng hợp Phổ tác dụng... Phân loại: Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính + Lên men mẻ + Lên men có bổ sung + Lên men liên tục + Lên men bán liên tục [7] 1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh 1.5.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh Đây là giai đoạn rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi... -200C) [13] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Bản chất của quá trình lên men Lên men thực chất là phản ứng oxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác của các enzym do VSV tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men [5], [13] 1.4.2 Giống vi sinh vật Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật là công cụ tác động và điều khiển lên quá trình sinh học còn... trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa kháng sinh cũng thay đổi Hiện nay, kháng sinh được định nghĩa như sau: Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh [3] 1.1.2 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách để phân loại: dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, dựa... ra + Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa về kháng sinh Thuật ngữ kháng sinh theo quan niệm truyền thống được định nghĩa là những chất do các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn ) tạo ra có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn khác Ngày nay, kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vi sinh. .. của chủng Biến chủng Streptomyces 15.29. 21.23 là biến chủng tốt nhất hiện nay mà chúng tôi tạo được Lên men chìm trên máy lắc và trong bình lên men 5 lít và 500 lít được thực hiện và kết quả là lên men trên máy lắc cho kết quả tốt nhất, còn lên men trên bình lên men 5 lít và 500 lít cho kết quả tương đương, tuy nhiên kém hơn lên men trên máy lắc nhiều Từ dịch lọc lên men kháng sinh chiết được tốt nhất... (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất [2] 14 1.7 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 Streptomyces Microflavus Trong số các kháng sinh chúng tôi phân lập được từ cơ chất Việt Nam có Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn có độ... rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng 8 Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định + Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym + Chất kháng sinh. .. kháng sinh Hình 1.1 giới thiệu sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [5] 4 Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm nghiệmnghiệm nghiệm Nhân giống quy mô thí nghiệm Nhân giống trong thiết bị nhân giống Lên men tổng hợp kháng sinh Dịch lên men Lọc, ly tâm Sinh khối Dịch lọc Dịch chiết sinh khối Dịch chiết Cô, tinh chế Sản phẩm tinh chế Kiểm nghiệm . tăng sinh tổng hợp kháng sinh. + Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp của chủng Streptomyces 15. 29, nghiên cứu chiết xuất, tinh chế kháng sinh do Streptomyces 15. 29 tạo ra. + Nghiên. môn Vi sinh- Sinh học trường đại học Dược Hà Nội, tôi chọn đề tài nghiên cứu: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15. 29 với các mục tiêu sau: + Nghiên cứu cải. 60% là từ Streptomyces. Bảng 1.2 giới thiệu một số kháng sinh do Streptomyces tổng hợp [6], [10]. Bảng 1.2: Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp Kháng sinh Chủng sinh tổng hợp Phổ tác