B ộ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • NGUYỄN THANH TÚ PHÂN LẬP 3 DẪN CHẤT XANTHON (a,p,Ỵ - MANGOSTIN) CHIỂT XUẤT TỪ Vỏ QUẢ MĂNG CỤT (GARCINIA MANGOSTANA L.) KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC sĩ ĐẠI HỌC • • • • • Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. Thái Duy Thìn 2. PGS. TS Hà Huy Ke Nơi thực hiện: 1. Bộ *môn Hóa Dược 2 . Viện Khoa học Công nghệ mới ( số 8 , Láng Hạ) HÀ NỘI-2011 _ ___ • _____ _____ LM cảm ơn Qua gần một năm làm đề tài với nỗ lực của bản thân và sự giúp đỡ nhiệt tình, tận tâm của thầy cô, gia đình và bạn bè, em đã hoàn thành luận văn của mình. Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Thái Duy Thìn, PGS. TS Hà Huy Kế, TS. Phan Quốc Kinh - những người thầy đã tận tâm chỉ bảo, giúp đỡ, rèn luyện em trong suốt quá trình làm đề tài. Em xin cảm ơn các thầy cô, các cán bộ của trưÒTig Đại học Dược Hà Nội, bộ môn Hóa Dược đã tạo mọi điều kiện để em học tập và làm luận văn. Em cũng chân thành cảm ơn Phân viện Công nghệ mới, Viện Khoa học- Công nghệ Quân sự đã tạo điều kiện cho em được nghiên cứu khoa học tại đây. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, cũng như làm luận văn. Hà Nội, tháng 5 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thanh Tú MỤC LỤC Nội dung Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỎNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu tổng quan về măng cụt 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân bố 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật 4 1.1.3. Thành phần hóa học 5 1.2. Tổng quan về các dẫn chất xanthon 7 1.2.1. Cấu trúc 7 1.2.2. Tổng hợp hóa học 8 1.2.3. Tính chất lý hóa của a,p,y- mangostin 8 1.3. Tác dụng và công dụng của quả măng cụt và xanthon 9 1.3.1. Theo y học cổ truyền 9 1.3.2. Theo y học hiện đại 9 1.4. Độc tính 11 1.5. Nguyên tắc chiết xuất 12 1.6. Tinh chế xanthon 12 1.7. Các phương pháp phân tích các dẫn chất xanthon 13 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1. Nguyên liệu, dụng cụ 14 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất 14 2.1.2. Máy móc và dụng cụ 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu 15 Chương 3. THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16 3.1. Kết quả thực nghiệm 16 3.1.1. Tóm tắt quy trình chiết xuất hỗn hợp xanthon 16 3.1.2. Tiến hành 17 3.1.2.1. Chiết cao măng cụt 17 3.1.2.2 Loại chất màu bằng than hoạt 17 3.1.2.3 Làm kết tủa hỗn hợp xanthon 17 3.1.2.4 Tinh chế xanthon qua sắc ký cột 18 3.1.2.5 Tách a,p,y- mangostin bằng sắc ký lớp mỏng điều chế 20 3.1.3. Phân tích các xanthon 21 3.1.3.1. Sắc ký lớp mỏng (SKLM) 21 3.1.3.2. Phân tích khối phổ (MS) 22 3.1.3.3. Phân tích phổ tử ngoại (UV) 23 3.1.3.4. Phân tích phổ hồng ngoại (IR) 25 3.1.3.5. HPLC 27 3.2. Bàn luận 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 1. Kếtluận 31 2. Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT CHỮ CÁI VIẾT TẮT Ý NGHĨA 1 NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Carbon 13) 2 DD Dung dịch 3 EA Ethylacetat 4 EtOH Ethanol 5 HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sac ký lỏng hiệu năng cao) 6 NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ proton) 7 IR InfraRed spectroscopy (Phô hông ngoại) 8 MeOH Methanol 9 MS Mass Spectrometry (Phô khôi) 10 SKLM Săc ký lớp mỏng 11 u v Ultraviolet Light (Phô tử ngoại) DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG 1 Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng trong thịt quả măng cụt 6 2 Bảng 2: Tách các dẫn chất xanthon qua sắc ký cột 20 3 Bảng 3: Bước sóng hấp thụ vùng tử ngoại của 3 dẫn chất xanthon (X) X2, X3) 25 4 Bảng 4: Kết quả phổ hồng ngoại của 3 dẫn chất xanthon (X,. X2, X3) 27 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT TÊN BẢNG TRANG 1 Hình 1 : Vùng trồng nhiều cây măng cụt ở Việt Nam 3 2 Hình 2: Hình ảnh quả măng cụt 4 3 Hình 3 : Sơ đồ chiết xuất xanthon 16 4 Hình 4: Dụng cụ Soxhlet 18 5 Hình 5; SKLM sản phẩm B (tủa xanthon thu được) 18 6 Hình 6 : sắc ký cột hỗn hợp xanthon 19 7 Hình 7; SKĨ M dẫn chất xanthon 21 8 Hình 8 ; Phổ khối của Xi 22 9 Hình 9: Phổ khối của X2 22 10 Hình 10; Phổ khối của X3 23 11 Hình 11 ; Phổ tử ngoại của Xi 23 12 Hình 12: Phổ tử ngoại của X2 24 13 Hình 13: Phổ tử ngoại của X3 24 14 Hình 14; Phổ hồng ngoại của X| 25 15 Hình 15 : Phổ hồng ngoại của X2 26 16 Hình 16; Phổ hồng ngoại của X3 26 17 Hình 17: sắc ký đồ HPLC của X], X2, X3 28 ĐẶT VẤN ĐÈ Quả măng cụt (Garcinia mangos tana L.) được xem là “ Nữ hoàng của trái cây” với hương vị đặc biệt của mình, ở nước ta măng cụt được trồng nhiều nhất tại Lái Thiêu, Thủ Dầu Một. Việt Nam đã có lúc là nơi có những vườn măng cụt lớn nhất thế giới, với những vưÒTi rộng hàng chục mẫu, có hàng ngàn cây, mỗi cây cho được từ 700 đến 900 quả. Măng cụt hiện được trồng nhiều tại Thái Lan, Campuchia, Myanmar, Sri Lanka và Philippin. Hiện có khoảng 10 loài khác nhau được nuôi trồng. Quả khô được gửi từ Singapore sang Ấn Độ và Trung Quốc để biến chế thành dược liệu. Nen y học cổ truyền Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ từ lâu đã sử dụng vỏ quả măng cụt để chữa bệnh tiêu chảy, lỵ, vàng da [3], [4]. Nghiên cứu hoá thực vật cho thấy quả măng cụt chứa các hydroxy- và prenyl xanthon, flavonoid, triteipenoid. Các hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, kháng virut, chống ôxy hoá, giảm đau [2], Khi được sử dụng với liều cao để đắp ngoài da của chuột, chất này đã không gây phản ứng phụ, trị được mụn và vết thương lành rất nhanh, xanthon diệt được các vi khuẩn như: tụ cầu vàng kháng penicillin hoặc methicillin, liên cầu khuẩn [35]. Do vậy đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới và ở Việt Nam. Nhiều nghiên cứu cho thấy có khoảng 40 xanthon tồn tại trong vỏ quả măng cụt. Trong đó, hoạt chất được nghiên cứu nhiều nhất là mangostin (gồm a-mangostin, ß-mangostin và y-mangostin). Hiện nay trên thế giới các hoạt chất của vỏ quả măng cụt đang được sử dụng rộng rãi với nhiều sản phẩm có chứa mangostin ở dạng thực phẩm chức năng như: Mangosteen Capsules, Xanthon Juice ở Việt Nam công ty Dược phẩm Kingphar cũng đã sản xuất ra sản phẩm Kingphar Phyma có chứa mangostin (Phụ lục 1). Từ trước tới nay ở Việt Nam đã có nhiều tác giả nghiên cứu chiết xuất và xác định thành phần của vỏ quả măng cụt [1], [5], tuy vậy những nghiên cứu này chỉ dừng lại ở phạm vi phòng thí nghiệm. Để góp phần nhỏ vào việc nghiên cứu quy trình chiết xuất và phân tích các hoạt chất của vỏ quả măng cụt, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập 3 dẫn chất xanthon (a,p,Ỵ- mangostin) chiết từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)” với mục tiêu: - Lựa chọn phương pháp chiết xuất và phân lập a,ị3,y-mangostin từ hỗn hợp xanthon, hoạt chất của vỏ quả măng cụt. - Nhận dạng các dẫn chất xanthon (a,p,y-mangostin) điều chế được bằng các phương pháp phân tích. Chưong 1. TỎNG QUAN 1.1. Giới thiệu tổng quan về măng cụt Măng cụt có tên khoa học; Garcinia mangostana L.Gaertn, thuộc họ Bứa Clusiaceae (Guttiferae). Tùy theo từng quốc gia măng cụt cũng có nhiều tên gọi khác nhau: mangosteen (Anh), mangostán (Tây Ban Nha), sơn trúc tử (Trung Quốc), manggis (Indonesia, Malaysia), mangkhut (Thái Lan, Lào) L U . Nguồn gốc và phân bố Cây măng cụt có nguồn gốc tìr Mã Lai, Nam Dương, từ Malacca qua Moluku, ngày nay bắt gặp khắp Đông Nam Á, Ấn Độ, Myanma cũng như ở SriLanka, Philippines, được các nhà truyền giáo đạo Gia tô di thực vào miền Nam Việt Nam, rồi trồng nhiều ở các tỉnh Tây Ninh, Gia Định, Thủ Dầu Một. Hiện nay măng cụt được trồng nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long (Bình Dương, Cà Mau, Kiên Giang, Tiền Giang, Vĩnh Long, cần Thơ, Đồng Tháp, Trà Vinh ) vì ở đây khí hậu nóng ấm nên cây dễ mọc, do đặc thù như vậy nó không tiến được lên miền Bắc xứ lạnh, xa lắm là đến Huế [4]. N* s ^ \ V ° I o o , o ____ _ . o ^ ef»*rww*Ci _ __ .9 «0CIMM6 MC Itu o o Hĩnh 1. Vùng ừ-ồng nhiều măng cụt ở Việt Nam [...]... hỗn họp xanthon EtOH Dịch hỗn hợp xanthon Dd NaCl bão hòa Loại nước l c và tạp Khuấy, để l nh 15°C/24 giờ L c Tủa xanthon Rửa nước cất, l c f S J Hôn hợp xanthon Hình 3 Sơ đồ chiết r xuât xanthon 17 3. 1.2 Tiến hành 3. 1.2.1 Chiết cao măng cụt Bột vỏ quả măng cụt được chiết bằng phương pháp Soxhlet với dung môi ethanol 9 5 ^ trong 8 giờ L m với 4 mẻ, mỗi mẻ chiết lOOg Tổng cộng l 400g vỏ quả măng cụt Gộp... pháp: SKLM, ư v , IR, MS, HPLC 16 Chương 3 THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3. 1 Kết quả thực nghiệm 3. 1.1 Tóm tắt quy trình chiết xuất hỗn hợp xanthon EtOH 95^ Bột vỏ quả măng cụt Bỏ bã Chiết bằng Soxhlet trong ị nhiệt độ 80°c, l c Dịch l c 8 giờ, Cất thu hồi dung môi Cao măng cụt Dd cao măng cụt Dd cao măng cụt đã loại chất màu Loại nước l c và tạp Dd NaCl bão hòa Khuấy, để l nh 15°C/24 giờ L c Tủa... • Từ dung dịch B ta thu được 2 băng của X2, X3 2 1 • Tách l p Siilicagel của các băng trên và chiết bằng MeOH, l c và l m bay hơi dung môi ta thu được Xi (120mg), X2 (920mg), X3 (47mg) 3. 1 .3 Phân tích các dẫn chất xanthon 3. 1 .3. L Sắc kỷ l p mỏng (SKLM) Độ tinh khiết của chất điều chế được xác định bằng SKLM: - Chất phân tích được hòa tan trong EtOH - Chất hấp phụ: Bản mỏng Silicagel 60 F254 (Merck)... các xanthon (1,6-dihydroxy3-methoxy-2-isoprenyl xanthon; gartanin; l, 5,8-trihydroxy -3- methoxy-2- isoprenyl xanthon) , ethyl methyl maleimid glucopyranosid [14], cùng những triterpenoid như cycloartenol, íriedlin, a-sitosterol, betulin, mangiferadiol, mangiferolic acid, cyclolanostendiol, hydroxy cyclolanostenon [25] Vỏ quả l phần được nghiên cứu nhiều nhất, nó chứa khoảna 40 xanthon (Phụ l c 2) [21]... sóng hấp thụ vùng tử ngoại của 3 dẫn chất xanthon (Xị X 2, X 3) ^rnax(nm) Các dẫn chất xanthon Môi trường trung tính Môi trường kiêm X, (hình 1 1) 244; 257 và 31 8 244; 257 và 36 5 X 2 (hình 1 2 ) 242 và 31 7 242; 31 7 và 37 0 X3 (hình 1 3) 260,5 và 32 1 260,5; 32 1 và 37 0 Nhận xét; Đặc trưng của các nhóm phenol trong a,P,Y-mangostin l các pic hấp thụ ở độ dài sóng 31 8nm, 31 7nm, 32 1nm ở môi trường trung tính... Ando N , Lee, H.H và Bennet, G.J; Lee, H.H tổng hợp toàn phần bằng phưong pháp hóa học (Phụ l c 4) [42] 1.2 .3 Tính chất l hóa của a,ß,y- mangostin Xanthon trong vỏ quả măng cụt được nghiên cứu nhiều l a,ß,ymaneostin và eartanin: • a-mangostin [8 ], [36 ]: Tên khoa học: butenyl)-9H-xanthen-9-one; l ,3, 6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis- (3- methyl- 2l ,3, 6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-di (3- methyl-2- butenyl) xanthon. ..  13 1.6 Tinh chế xanthon Đe tinh chế các dẫn chất xanthon từ cao măng cụt nhiều tác giả đã áp dụng các phương pháp thông dụng như: • Sắc ký cột với chất hấp phụ l silicagel 60 (Merck) [44] hoặc Woelm acid alumina grade III [37 ] Sau đó rửa giải bằng các hỗn họfp dung môi từ ít phân cực đến phân cực hơn để tách các hợp chất • Sắc ký l p mỏng điều chế (preparative chromatography) để phân l p riêng từng... hợp chất [8 ’ 1.7 Các phương pháp phân tích các dẫn chất xanthon • Sắc ký l p mỏng [8 ], [39 ]: ■ Chất hấp phụ l silicagel 60 F254 (Merck) và với các hệ dung môi như: CéH6 - MeOH (95 : 5); CHCI3 - Hexan (90 : 1 0) CHCI3 - Ethylacetat - MeOH (80 : 10: 5) CóHó - Ethylacetat (75 : 5) hoặc (17 : 3) ■ Thuốc thử hiện màu [39 ]: - Phun dung dịch FeCls 5% - Xông hơi lod - Phun dung dịch H2SO4 trong ethanol sau... C24H26O6 TLPT: 410,46 Độ chảy: 180 - 181°c (CôHó - petrolether) • ß-mangostin: Tên khoa học; l, 6-dihydroxy -3, 7-dimethoxy-2,8-bis- (3- methyl-2butenyl)-9H-xanthen-9-one; l, 6-dihydroxy -3, 7-dimethoxy-2,8-di (3- methyl-2butenyl) xanthon CTPT: C25H28O6 TLPT: 424,49 Độ chảy: 1 73 - 174°c [8 ] • y-mangostin: Tên khoa học: l ,3, 6,7-tetrahydroxy-2,8-bis- (3- methyl-2-butenyl)-9Hxanthen-9-one; 1 ,3, 6,7-tetrahydroxy-2,8-di (3- methyl-2-butenyl)... -D:\phantich\Data-20li\Flavoniid\mau so2a.dat, DAD -32 0 nm Hình 17 Sắc kỷ đồ HPLC của Xi, X 2 , X 3 maula: x¡ ; maula: X 2 ; mau3: X 3 29 Thời gian l u (phút) của X], X2, X3 l : X,: 18.91 phút X2: 13, 31 phút X3; 29,17 phút Vì không có chất chuẩn nên các các chất a,P,y-mangostin được xác định qua phổ khối (MS) và cũng được so sánh với các tài liệu tham khảo [8,26,29 ,34 ,36 ,38 ,39 , 43, 44] X] l P-mangostin có . (a,p,Ỵ- mangostin) chiết từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L. ) với mục tiêu: - L a chọn phương pháp chiết xuất và phân l p a, 3, y-mangostin từ hỗn hợp xanthon, hoạt chất của vỏ quả măng cụt. -. 20 3. 1 .3. Phân tích các xanthon 21 3. 1 .3. 1. Sắc ký l p mỏng (SKLM) 21 3. 1 .3. 2. Phân tích khối phổ (MS) 22 3. 1 .3. 3. Phân tích phổ tử ngoại (UV) 23 3.1 .3. 4. Phân tích phổ hồng ngoại (IR) 25 3. 1 .3. 5 • NGUYỄN THANH TÚ PHÂN L P 3 DẪN CHẤT XANTHON (a,p,Ỵ - MANGOSTIN) CHIỂT XUẤT TỪ Vỏ QUẢ MĂNG CỤT (GARCINIA MANGOSTANA L. ) KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC sĩ ĐẠI HỌC • • • • • Người hướng dẫn: 1. PGS.