BỘYTẾ TRƯÒTVG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • NGUYỄN THỊ NGUYÊN NGHIÊN CÚtJ XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT số • • • CHẤT PHÂN LẬP TỪ HOA CÂY GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ • • • Giáo viên hưÓTig dẫn: PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu Noi thực hiện: Bộ môn Hóa Phân Tích Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội HÀ NÔI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài ''Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo”, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, chu đáo của các thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhờ có sự giúp đỡ quý báu đó đã giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thái An - Bộ môn Dược Liệu, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền và DS. Phạm Lê Minh đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ, cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Tnrờng Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy, các anh chị kỹ thuật viên đã truyền cho tôi những kiến thức thực sự bổ ích trong suốt quá trình học tập tại tmờng. Và cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, để tôi có được kết quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm cm ! Hà Nội ngày 14 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Nguyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỰC CÁC HÌNH ẢNH, Đồ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN I-TỔ NG QUAN 2 1.1. TỐNG QUAN VỀ CÂY GẠO 2 1.1.1. Đặc điểm thực v ật 2 1.1.2. Phân bố 2 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 3 1.1.4. Thành phần hóa học của hoa Gạo . 3 1.1.5. Tác dụng sinh học của hoa Gạo 3 1.1.6. Tính vị, công năng, chủ trị theo y học dân gian 4 1.2. VÀI NÉT VỀ HAI CHẤT PHÂN LẬP Đ ược TỪ HOA CÂY GẠO 5 1.2.1. Aurantiamid acetat 5 1.2.1.1. Nguồn gốc: 5 1.2.1.2. Tính chất 5 1.2.1.3. Tác dụng 6 1.2.2. Ergosterol peroxid 6 1.2.2.1. Nguồn gốc 6 1.2.2.2. Tính chất 6 1.2.2.3. Tác dụng 7 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 7 1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký 7 1.3.2. Các thông số đặc trưng trong HPLC 9 1.3.3. ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm dược liệu 12 1.3.3.1. Định tính dược liệu 12 1.3.3.2. Định lượng 12 1.4. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỒ (LC-MS) 14 1.4.1. Khối phổ 14 1.4.1.1. Nguồn ion (lon source) 14 1.4.1.2. Thiết bị phân tích khối phổ (Mass Analyzer) 15 1.4.1.3. Detector 15 1.4.2. Một số kỹ thuật LC-MS 16 1.4.3. ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất 16 PHẦN II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PÍĨƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ú tJ 17 2.1. ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIỂT B Ị 17 2.1.1. Đối tượng 17 2.1.2. Hóa chất và thiết b ị 17 2.1.2.1. Hóa chất 17 2.1.2.2. Thiết b ị 17 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u 18 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 18 2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử 18 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc (chuẩn gốc) 20 2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 20 2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích 21 2.3.4.I. Độ phù họp của hệ thống sắc ký 21 2.3A.2. Tính đặc hiệu 21 2.3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính, đường chuẩn 21 2.3.4.4. Độ lặp lại của phương pháp 22 2.3.4.5.ĐỘ đúng 22 2.3.4.6. Giói hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 22 2.3.5. Phương pháp xử lý kết quả 23 2.3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 23 2.3.5. Phương pháp xử lý kết qu ả 23 PHẦN III - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU THỬ 24 3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu 24 3.1.2. Hiệu suất chiết 24 3.2. KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC K Ý 25 3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN C Ú tJ 26 3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CÚXl TRONG HOA GẠO 27 3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 29 3.5.1. Khảo sát sự phù họp của hệ thống sắc ký 29 3.5.2. Khảo sát tính đặc hiệu 30 3.5.3. Khảo sát độ lặp lại 31 3.5.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 31 3.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 33 3.5.6. Khảo sát độ đúng 34 3.6. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÊ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG HOA GẠO 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 KỂTLƯẬN 36 ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ đầy đủ 1 ALT Alanine transaminase 2 AST Aspartate transaminase 3 DDVN Dược điển Việt Nam 4 DPPH l,l-diphenyl-2-picryhydrazyl 5 ESI lon hóa bằng phun điện tử (Electron spraỵ ionization) 6 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 7 IFN -ỵ Interferon- y 8 IL Interleukin 9 LC-MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography - Mass Spectrometry) 10 LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) 11 LOQ Giới hạn định lưọng (Limit of Quantification) 12 MeCN Acetonitril 13 MeOH Methanol 14 PHA Phytohemagglutinin 15 RSD Độ lệch chuân tưomg đôi (Relative Standard Deviation) 16 S/N Tín hiệu/nhiễu đưỏng nền (Signal/Noise) 17 SD Độ lệch chuân (Standard Deviation) 18 STT So thứ tự 19 TNF Tumour necrosis factor 20 tR Thời gian lưu 21 UV-VIS Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Ký hiệu Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1 Ket quả xác định độ ẩm bột hoa Gạo 24 2 Bảng 3.2 Ket quả khảo sát tính thích họp 29 3 Bảng 3.3 Ket quả khảo sát độ lặp lại 31 4 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của aurantiamid acetat 32 5 Bảng 3.5 Ket quả khảo sát độ tuyến tính của ergosterol peroxid 32 6 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng với aurantiamid acetat 34 7 Bảng 3.7 Kêt quả khảo sát độ đúng với ergosterol peroxid 34 8 Bảng 3.8 Ket quả xác định hàm lưọng từng chất trong mẫu hoa Gạo nghiên cứu 35 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ Đồ THỊ STT Kí hiệu Tên hình Trang 1 Hình 1.1 Hình ảnh cây Gạo 2 2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của aurantiamid acetat 5 3 Hình 1.3 Hình ảnh tinh thê aurantiamid acetat 5 4 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của ergosterol peroxid 6 5 Hình 1.5 Hình ảnh tinh thế ergosterol peroxid 7 6 Hình 1.6 Mô hình cẩu tạo máy HPLC 8 7 Hình 1.7 Sơ đồ bộ tứ cực chập ba 15 8 Hình 3.1 Sắc ký đồ hỗn họp chất nghiên cứu aurantiamid acetat và ergosterol peroxỉd 26 9 Hình 3.2 Sắc ký đồ của mẫu thử chuẩn bị tử hoa Gạo 26 10 Hình 3.3 Sắc kỷ đồ của auratiamid acetat phân lập từ hoa cây Gạo 27 11 Hình 3.4 Sắc ký đồ của ergosterol peroxid phân lập từ hoa cây Gạo 27 12 Hình 3.5 Phô khổi lượng ứng với pic của aurantiamid acetat trên sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hỗn họp chất đối chiếu 28 13 Hình 3.6 Phổ khối lượng ứng với pic của ergosterol peroxid trên sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hỗn họp chất đối chiểu 28 14 Hình 3.7 Sắc ký đồ của mâu trắng (pha động) 30 15 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của aurantiamid acetat 32 16 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của ergosterol peroxid 33 - 1 - ĐẶT VẤN ĐỀ Như chúng ta đã biết, cây Gạo còn có tên gọi khác là Mộc miên, Gòn rừng, cổ bối là một loài rất gần gũi và quen thuộc với mỗi người dân Việt Nam đặc biệt là người dân miền Bắc. Cây Gạo phân bố nhiều ở các tỉnh từ Quảng Bình trở ra, được trồng nhiều không chỉ đế lấy bóng mát mà còn là nguồn dược liệu quý sẵn có. Theo kinh nghiệm dân gian, người dân đã quen thu hái nhiều bộ phận khác nhau từ cây Gạo để phòng và chữa bệnh, trong đó hoa Gạo được sử dụng cho người thiếu máu nhược sắc, rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày, mất máu sau mổ, giúp ăn ngủ tốt, tăng cân [4], [5], [9]. Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu hóa thực vật cũng như thử tác dụng sinh học của hoa Gạo và cho kết quả rất đáng ngạc nhiên về tiềm năng chữa các bệnh “thời đại” như tác dụng bảo vệ tim mạch [40], hạ huyết áp [33], bảo vệ gan [30] ở Việt Nam, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền là người đầu tiên nghiên cứu toàn diện về hoa cũng như tất cả các bộ phận của cây Gạo, đã nhận biết, chiết xuất và phân lập được một số thành phần từ hoa Gạo là aurantiamid acetat, ergosterol peroxid. Tuy nhiên, hiện nay chưa có tài liệu nào trên thế giới cũng như tại Việt Nam công bố hàm lượng các thành phần hoạt chất trong hoa Gạo. Đe làm rõ hơn về hàm lượng các họfp chất phân lập được có trong hoa Gạo, đề tài '"Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo'' đã được thực hiện với mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính và định lượng đồng thời aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trong hoa Gạo bằng phương pháp HPLC để góp phần vào việc tiêu chuẩn hóa chất lượng vị thuốc hoa Gạo. 2. ưng dụng phươiig pháp đê sơ bộ xác định hàm lưọng aumntiamid acetat và ergosterol peroxid trong một mẫu hoa Gạo thu hái được. - 2 - Hĩnh 1.1. Hình ảnh cây Gạo PHẦN I - TỎNG QUAN 1.1. TÓNG QUAN VỀ CÂY GẠO 1.1.1. Đặc điểm thực vật - Cây Gạo còn gọi là Gòn rừng, Gạo rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu, Bông Gạo, Anh hùng thụ, Hồng miên, cổ bối [8], [13], - Tên khoa học: Bombax malabaricum DC. Thuộc họ Gạo (Bombacaceae) [8], [13]. - Cây Gạo có thể cao tód 15 m hoặc hơn, thân gỗ sần sùi, có bạnh vè to ở gốc và có gai hình nón. Cành hình trụ, mọc ngang, lá mọc so le, kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét hình mác, gốc thuôn, dài 9-15 cm, rộng 4-5 cm [8]. [13]. - Hoa có màu đỏ, mọc thành chùm đầu cành. Đài dày, màu nâu xám, hình chuông bọc lấy nụ hoa, khi hoa nở võ thành 3-5 mảnh có răng tù và ngắn. Tràng 5 cánh nạc, rời nhau, mặt ngoài phủ lông nhung. Nhị rất nhiều hợp thành 5 bó, ngắn hơn cánh hoa. Bầu thượng, hình nón, có lông màu trắng nhạt, bầu 5 ô, một vòi mang 5 đầu nhụy [13]. - Quả nang 5 cạnh, hình thoi, dài 8-15 cm, khi chín nứt thành 5 mảnh [13], Hạt hình trứng, màu nâu [5]. 1.1.2. Phân bố - Trên thế giói, cây Gạo phân bố ở nhiều châu lục như châu úc, châu Mỹ, châu Á Đặc biệt cây sống rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới Châu Á như: Bhutan, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam [5], [18]. - ở Việt Nam, cây Gạo được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Bình trở ra. Cây thường mọc tự nhiên ở đất trống ven rừng, đồi và nhất là dọc theo các bờ sông suối. Cây hay được trồng ở đình chùa, ven đường, hay đầu làng để lấy bóng mát [13]. [...]... hợp chất nghiên cứu với nhau và với các họp chất khác trong cao lỏng hoa Gạo - Định tính các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết nối - Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cẩu trúc và xác định tổng tạp bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích - Áp dụng phương Dháp HPLC để sơ bộ xác định hàm lượng. .. Độ đúng Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Khảo sát độ đúng của phương pháp là dựa vào phương pháp thêm chuẩn Nguyên tắc của phương pháp là thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu thử đã được xác định nồng độ sao cho lượng hoạt chất thêm vào và lượng mẫu thử vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp Độ đúng phải được... phân lập được từ hoa cây Gạo Hình 3.4 sẳc ký đồ của ergosterol peroxidphân lập được từ hoa cây Gạo Các sắc ký đồ ở hình 3.3 và hình 3.4 cho thấy cả 2 họp chất đều không xuất hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 20 phút) nên có thể sử dụng các họp chất này làm nguyên liệu để thiết lập chất đổi chiếu Tuy nhiên do lượng các hợp chất phân lập được còn ít và chưa đủ thời gian cho phép để thiết lập. .. 13.3.2 Định lượng [2] - Tất cả các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó - Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký là; • Phương pháp chuẩn ngoại • Phương pháp chuẩn nội • Phương pháp thêm chuẩn • Phưong pháp chuẩn hóa diện tích - Trong khuôn khổ của luận văn này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn... và giói hạn định lượng (LOQ) - Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của hoạt chất cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được => LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó chiều cao pic của hoạt chất gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N = 3) - Giới hạn định lượng (LOQ) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được... và chưa đủ thời gian cho phép để thiết lập chất chuẩn, do vậy tôi tạm dùng chúng như chất đối chiếu để khảo sát phương pháp định lượng chúng trong hoa Gạo 3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHÁT NGHIÊN CÚXJ TRONG HOA GẠO Tiến hành nhận dạng các pic có cùng thời gian lưu trên sắc ký đồ mẫu thử được chuẩn bị từ hoa Gạo và dung dịch hỗn hợp 2 chất nghiên cứu bằng phổ khối lượng với kĩ thuật LC/MS Chế độ đo: ESI+ với... hàm lượng 2 hợp chất trên có trong mẫu hoa Gạo thu hái được 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.3.1 Xử lý và chuẩn bị mẫu thử Muốn định lượng được hoạt chất trong dược liệu nói chung cũng như định lượng được aurantiamid acetat và ergosterol peroxid nói riêng, vấn đề đầu tiên cần quan tâm là lựa chọn phương pháp chiết thích họp Phương pháp đó phải đảm bảo chiết kiệt được hoạt chất cần định lượng và dịch chiết... điều kiện sắc ký ** Cột sắc ký x Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết, định lượng một số thành phần trong cây Gạo, tôi thấy các phương pháp đều sử dụng sắc ký pha đảo Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng khá phổ biến vói nhiều tính ưu việt Do đó, tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này Sử dụng cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250 mm X... HAI CHẤT PHÂN LẬP Đ ư ợ c TỪ HOA CÂY GẠO 1.2.1 Aurantỉamid acetat 1.2.1.1 Nguồn gốc - Aurantiamid acetat là hợp chất đã được tìm thấy từ nhiều loài khác nhau: nó có thể phân lập được từ các loài Acantophora spicifera, Aspergillus penicỉlloides [20], từ thảo dược Brillantaisia lamium [38] Phân lập từ vỏ cây Albizia adianthifolia [39], hoặc từ vỏ cây Pỉerreodendron kerstingii, một loài thực vật thuộc họ... lặp lại của phương pháp Là độ chính xác của tổng thể quá trình phân tích, được biểu thị bằng giá trị RSD% của kết quả phân tích của mẫu độc lập trong cùng một điều kiện phân tích Cách xác định: - Phân tích 1 mẫu 6 lần song song - Xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện - Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng 23.4.5 . bố hàm lượng các thành phần hoạt chất trong hoa Gạo. Đe làm rõ hơn về hàm lượng các họfp chất phân lập được có trong hoa Gạo, đề tài '" ;Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng. BỘYTẾ TRƯÒTVG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • NGUYỄN THỊ NGUYÊN NGHIÊN CÚtJ XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT số • • • CHẤT PHÂN LẬP TỪ HOA CÂY GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ • • • Giáo viên. pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo& apos;' đã được thực hiện với mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính và định lượng đồng thời aurantiamid