BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ ĐỨC HOÀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH MACROLID TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ ĐỨC HOÀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH MACROLID TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. DS. Lê Xuân Kỳ Nơi thực hiện: 1. Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia. 2. Bộ môn Vật lý – Hóa lý. HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện, khóa luận “Xây dựng phương pháp xác định dư lượng một số kháng sinh macrolid trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” đã hoàn thành. Bên cạnh sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ và giúp đỡ từ phía nhà trường, bộ môn, gia đình và bạn bè. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới DS. Lê Xuân Kỳ, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới DS. Dương Thị Vân, DS. Nguyễn Thị Hạnh đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin gửi cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và những người luôn động viên, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2015 Sinh viên VŨ ĐỨC HOÀN MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2 1.1.1. Tổng quan về nhóm Macrolid 2 1.1.2. Tổng quan về Azithromycin 5 1.1.3. Tổng quan về Clarithromycin 6 1.1.4. Tình trạng đề kháng của vi khuẩn 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 9 1.2.1. Thiết bị khối phổ 10 1.2.2. Một số kỹ thuật ghi phổ 12 1.2.3. Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ 13 1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC MACROLID 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 16 2.2.1. Hoá chất – thuốc thử - chất chuẩn 16 2.2.2. Thiết bị - dụng cụ 16 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1. Xây dựng, thẩm định phương pháp 17 2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 22 3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ 22 3.1.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký 25 3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 27 3.2.1. Độ lặp lại hệ thống 27 3.2.2. Độ đặc hiệu, độ chọn lọc 28 3.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 29 3.2.4. Độ lặp lại của phương pháp 31 3.2.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 33 3.2.6. Độ đúng của phương pháp 34 3.2.7. Độ thu hồi 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AZI CLARI DAD EPA IS HPLC LC - MS/MS MS t R S pic MeOH LOD LOQ LQC MQC HQC SPE R(%) SD RSD Tiếng Anh Azithromycin Clarithromycin Diode array detector Environmental Protection Agency Internal standard High performance liquid chromatography High performance liquid chromatography Tandem Mass Spectrometry Mass Spectrometry Retention time Area under the peak Methanol Limit of Detection Limit of Quantitation Low Quantitative Concentration Medium Quantitative Concentration High Quantitative Concentration Solid Phase Extraction Recovery Standard Deviation Relative Standard Deviation Tiếng Việt Azithromycin Clarithromycin Detector chuỗi diod Cục bảo vệ môi trường Mỹ Chuẩn nội Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần Khối phổ Thời gian lưu Diện tích pic Methanol Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Nồng độ định lượng thấp Nồng độ định lượng trung bình Nồng độ định lượng cao Chiết pha rắn Hiệu suất thu hồi Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn tương đối DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số kháng sinh nhóm Macrolid 4 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện ion hóa 23 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát điều kiện bắn phá 23 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại hệ thống 27 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn 30 Bảng 3.5. Kết quả độ lặp lại ở nồng độ LQC 32 Bảng 3.6 Kết quả độ lặp lại ở nồng độ MQC 32 Bảng 3.7. Kết quả độ lặp lại ở nồng độ HQC 33 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng 35 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ thu hồi. 35 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo của một số vòng lacton. 2 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của Azithromycin. 5 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Clarithromycin. 6 Hình 1.4. Cấu tạo thiết bị khối phổ 11 Hình 3.1. Kết quả khảo sát ion hóa tạo ion mẹ của CLARI (a) và AZI (b) 24 Hình 3.2. Phổ đồ khảo sát ion con của các kháng sinh CLARI (a), AZI (b) và chất chuẩn nội CIPRO-13C3 (c) 24 Hình 3.3. Sắc ký đồ của tổng 3 chất (a) và sắc ký đồ từng mảnh ion sản phẩm của CLARI (b) và AZI (c) và chuẩn nội (d) 26 Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thêm chuẩn (c) 29 Hình 3.5. Đường chuẩn dung dịch Clarithromycin 30 Hình 3.6. Đường chuẩn dung dịch Azithromycin 31 Hình 3.7. Sắc ký đồ của CLARI (a) và AZI (b) tại giới hạn phát hiện của mỗi chất. 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hướng nghiên cứu về dư lượng kháng sinh và các loại dược phẩm nói chung có trong môi trường ngày nay rất được quan tâm ở các nước phát triển. Lý do vì kháng sinh là một trong những nhóm hoạt chất đóng vai trò rất quan trọng trong phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, bên cạnh đó một lượng lớn thuốc kháng sinh còn được sử dụng trong chăn nuôi, trồng trọt, chế biến thủy hải sản. Việc sử dụng kháng sinh một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát dẫn tới tình trạng vi khuẩn kháng lại kháng sinh với mức độ ngày càng trầm trọng. Dư lượng kháng sinh trong môi trường được đánh giá là một trong những nguyên nhân của tình trạng kháng thuốc này. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh được mối liên hệ giữa nồng độ dư lượng kháng sinh trong môi trường với khả năng đề kháng lại kháng sinh của vi khuẩn. Trong những năm gần đây thì tại Việt Nam, số lượng và chủng loại kháng sinh được sản xuất ngày càng nhiều, trong đó nhóm kháng sinh macrolid là một trong những nhóm có số lượng sản xuất và sử dụng rất lớn [2]. Vì vậy trong quá trình sản xuất và sử dụng nhóm kháng sinh này thì vấn đề kiểm soát dư lượng kháng sinh thải ra môi trường cần phải được quan tâm đúng mức. Điều này đòi hỏi phải xây dựng được một phương pháp định lượng có độ tin cậy để làm công cụ đánh giá. Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng một số kháng sinh macrolid trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” đề tài được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Lựa chọn các điều kiện và xây dựng qui trình định lượng đồng thời hai kháng sinh Clarithromycin và Azithromycin trong nước thải bằng phương pháp LC-MS/MS. 2. Thẩm định phương pháp phân tích. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1. Tổng quan về nhóm macrolid Erythromycin là kháng sinh đầu tiên thuộc nhóm macrolid được dùng rộng rãi nhất, bắt đầu sử dụng trên lâm sàng từ nǎm 1952. Cho tới những nǎm 1990, erythromycin và một macrolid dùng không thường xuyên là troleandomycin là 2 đại diện của nhóm này. Nǎm 1991, azithromycin và clarithromycin được tổng hợp và đưa ra thị trường, nǎm 1995 dirithromycin có mặt trên thị trường. Các thuốc mới xuất hiện này có tiến bộ rõ rệt so với erythromycin mặc dù giá đắt hơn [19]. 1.1.1.1. Cấu trúc nhóm macrolid Các macrolid là những kháng sinh có cấu trúc heterosia mà phần genin là một vòng lacton có chứa nhiều nguyên tử (thường từ 12-17 hoặc nhiều hơn) và được chia thành 2 nhóm chính: nhóm kháng khuẩn và nhóm kháng nấm hay còn gọi là các polyen. Nhóm macrolid kháng khuẩn bao gồm các macrolid có cấu trúc vòng lacton (chứa từ 12-17 cấu tử - còn gọi là vòng esther) có chứa 1 hay nhiều đường (deoxy sugar) (thường là cladinose và desosamin). Hình 1.1: Công thức cấu tạo của một số vòng lacton. [...]... Ionization – APPI) Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả [1],[6],[11] 1.2.2 Một số kỹ thuật ghi phổ Trong phân tích khối phổ việc xác định chính xác 1 ion rất quan trọng cho việc xác định được hợp chất cần phân tích Một hợp chất xác định trong những điều kiện nhất định sẽ cho 1 ion có số khối xác định trên phổ đồ Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên phổ đồ lại... KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 3.1.1 Khảo sát các điều kiện khối phổ Để phân tích dư lượng kháng sinh bằng sắc ký lỏng khối phổ tứ cực chập ba cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) Với kỹ thuật ion hóa ESI, chế độ ion dư ng, các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+, một số trường hợp thêm hai proton [M-2H]++ Tuy nhiên để định tính và định lượng. .. tạo ra các chủng kháng thuốc  Kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, trồng trọt và chế biến thủy hải sản Không kiểm soát được nồng độ tồn dư dẫn đến một loạt kháng sinh chưa qua chuyển hóa từ các ngành này thải ra môi trường gây biến đổi đáp ứng của vi sinh vật 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry) là một phương pháp phân tích dụng... trong vừa đủ 1ml MeOH rồi đem đi định lượng 2.3.1.3 Lựa chọn các điều kiện sắc ký lỏng khối phổ Xây dựng quy trình phân tích sao cho có thể sử dụng định lượng đồng thời các kháng sinh nghiên cứu và một số kháng sinh macrolid khác Tiến hành khảo sát để lựa chọn các điều kiện sau đây:  Khảo sát điều kiện khối phổ: + Nguồn ion hóa + Điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con + Lựa chọn ion con để định lượng, ... trạng kháng thuốc và những biện pháp hữu hiệu để kiểm soát tình hình Một số nhóm nguyên nhân hàng đầu được cho là:  Lạm dụng sử dụng kháng sinh, thiếu kiến thức về sử dụng kháng sinh hợp lý  Thiếu cơ chế kiểm soát lượng kháng sinh tồn dư thải ra môi trường từ các nguồn: nước thải bệnh viện, nước thải từ các nhà máy sản xuất dư c phẩm và thú y Nguồn chất thải này chứa một lượng đáng kể kháng sinh lâu... khối phổ thường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp như định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong dịch sinh học, độc chất học, định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dư c liệu, thủy hải sản và môi trường Ngoài ra phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định mức độ tinh khiết của chất... Toledo (chính xác đến 0,01mg), Mỹ - Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 Pierce Reacti – Therm / #18822, Mỹ - Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Xây dựng, thẩm định phương pháp 2.3.1.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu thải trước khi tiến hành chiết tách - Mẫu nước thải không chứa kháng sinh nghiên cứu lấy tại bể nước thải thứ cấp của Xí nghiệp dư c phẩm TW2 đựng trong chai... CLARI và AZM Hệ số biến đổi và sai số tương đối ít hơn 9% và +/- 7% Phương pháp phân tích được chứng minh là có ích trong việc xác định các đặc tính dư c động học của EM, CLARI, RXM, và AZM ở chuột [22] Trong đề tài nghiên cứu về dư lượng kháng sinh macrolids, sulfonamids và trimethoprim ở lưu vực sông Mê Kông, Satoshi Managaki và cộng sự đã sử dụng phương pháp LC/MS/MS với cột sắc ký YMC pro C18 (3... đã đến, khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ  Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system) 11 Hình 1.4 Cấu tạo thiết bị khối phổ Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ Nguyên nhân là do quá trình phân tích... chọn Tiêm 3 lần mỗi mẫu Tính giá trị trung bình Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích kháng sinh/ diện tích píc của chuẩn nội với nồng độ kháng sinh tương ứng và từ đó tính hệ số tương quan r  Độ đúng của phương pháp: Mẫu trắng xử lí qua cột thu được nền mẫu Thêm chính xác một lượng kháng sinh đã biết trước nồng độ Tiến hành sắc ký và tìm lại nồng độ ban đầu  Độ lặp lại: đánh . ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ ĐỨC HOÀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH MACROLID TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ ĐỨC HOÀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH MACROLID TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ . tài: Xây dựng phương pháp định lượng một số kháng sinh macrolid trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ đề tài được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Lựa chọn các điều kiện và xây dựng qui