BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT n-HEXAN TỪ RỄ CỦ THỔ PHỤC LINH (Smilax glabra Wall. ex Roxb.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Hà Nội 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT n-HEXAN TỪ RỄ CỦ THỔ PHỤC LINH (Smilax glabra Wall. ex Roxb.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Đào Thị Thanh Hiền 2. TS. Nguyễn Tiến Đạt Nơi thực hiện: Viện Hoá sinh biển- Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam Hà Nội 2015 Lời cám ơn Lời đầu tiên cho em xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới TS.Đào Thị Thanh Hiền- giảng viên bộ môn Dược học cổ truyền Trường Đại học Dược Hà Nội, TS.Nguyễn Tiến Đạt- Trưởng phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá sinh biển, là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện và hướng dẫn em thực hiện đề tài này. Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo, cho em những kiến thức quý báu trong 5 năm qua. Xin chân thành cám ơn các anh chị làm việc tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá sinh biển đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận. Hà Nội ngày 14 tháng 5 năm 2015 SV. Nguyễn Thị Lan Mục lục DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về Thổ phục linh 3 1.1.1. Vị trí, phân loại chi smilax 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của thổ phục linh (Smilax glabra) 3 1.1.3. Thành phần hóa học 4 1.1.4. Công dụng của vị thuốc 9 1.1.5. Một số sản phẩm chứa Thổ phục linh trên thị trường 12 1.2. Tổng quan về enzym α –glucosidase 13 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1. Nguyên liệu 15 2.1.2. Hóa chất, thuốc thử 15 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1. Nghiên cứu về thành phần hoá học có trong phân đoạn dịch chiết n- hexan từ rễ củ Thổ phục linh 17 2.2.2. Thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase (thử in vitro) 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp chiết 17 2.3.2. Các phương pháp sắc ký 17 2.3.3. Các phương pháp phân tích cấu trúc bằng phổ 18 2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế α-glucosidase 18 2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu 18 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Phân lập các hợp chất 20 3.2. Xác định cấu trúc 21 3.3. Thử hoạt tính ức chế α-glucosidase 25 3.3.1. Quá trình tiến hành 25 3.3.2. Kết quả 25 BÀN LUẬN 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 31 1. Kết luận 31 2. Đề xuất 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 35 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường NMR Nuclear magnetic resonance H-NMR Hidro Nuclear magnetic resonance C-NMR Carbon Nuclear magnetic resonance Rha Rhamnosyl Glc Glucosyl DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) PEESG Phenolic-Enriched Extracts of Smilax glabra IL-6 Interleukin-6 TNF-α Tumor necrosis factor alpha SG Smilax glabra MIC Minimum inhibitory concentration p-NPG p- nitrophenyl-  - D- glucopyranoside DMSO Dimethy sulfoxid IC 50 Inhibitory concentration 50% SKLM Sắc ký lớp mỏng CC Colounm chromatography DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng1.1 Các hợp chất acylsucrose Trang5 Bảng 1.2 Các hợp chất flavanon Trang 7 Bảng 2.1 Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzym α- glucosidase Trang 14 Bảng 3.1 Kết quả tỷ lệ phần trăm ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết và chất sạch ở nồng độ 100 µg/mL Trang 26 Bảng 3.2 Giá trị IC 50 của acid betulinic và acarbose (µg/mL) Trang 26 Bảng 3.3 Kết quả tính ức chế enzym α-glucosidase khi dùng kết hợp acarbose và acid betulinic (tỷ lệ 1/1) Trang 27 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 3.1 Phổ 1 HNMR của hợp chất (1) Trang22 Hình 3.2 Phổ 13 CNMR của hợp chất (1) Trang 23 Hình 3.3 Phổ DEPT của hợp chất (1) Trang 24 Hình 3.4 Đồ thịtỷ lệ phần trăm ức chếα-glucosidase của cao chiết và chất sạch ở nồng độ 100 µg/mL Trang27 Hình 3.5 Đồ thịtỷ lệ phần trăm ức chế enzym α-glucosidase khi dùng đơn độc và dùng kết hợp acarbose và acid betulinic Trang28 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) là một nhóm các rối loạn chuyển hoá, đặc trưng bởi đường huyết tăng cao, liên quan đến sự bất thường về carbohydrate, lipid và protein. Bệnh gây ra các biến chứng mạn tính trên nhiều cơ quan như: biến chứng mạch máu nhỏ, biến chứng mạch máu lớn, rối loạn thần kinh, biến chứng trên thận, trên mắt Đây cũng là một trong những nguyên nhân hàng đầu dẫn tới tử vong, tổ chức Y tế thế giới dự báo đái tháo đường sẽ trở thành nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ 7 trên thế giới vào năm 2030 . Hiện nay, mục tiêu điều trị ĐTĐ chủ yếu là để duy trì mức đường huyết ổn định và đề phòng biến chứng. Trong phác đồ điều trị tiểu đường hiện nay, acarbose (thuốc nhóm ức chế α- glucosidase) là một trong những nhóm thuốc được dùng phối hợp với metformin khi thất bại với liệu pháp đơn trị liệu bằng thuốc không insulin. Đây là nhóm thuốc có nhiều ưu điểm như: làm giảm đường huyết sau ăn, không gây tụt đường huyết và không làm tăng tiết insulin[1]. Tuy nhiên, giá thành cho việc điều trị lâu dài tương đối cao; thuốc cũng có nhiều tác dụng không mong muốn như đầy hơi, trướng bụng, đau bụng, tiêu chảy, có thể gây rối loạn chức năng gan, ngứa, phát ban…Chính vì thế, việc nghiên cứu tìm kiếm các thuốc mới từ dược liệu có tác dụng hạ đường huyết hiệu quả, an toàn, giá rẻ, ít tác dụng phụ đang là vấn đề được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm. Thổ phục linh được trồng ở nhiều nơi trên khắp Việt Nam, là vị thuốc khá phổ biến trong dân gian. Từ xưa, nhân dân ta đã sử dụng Thổ phục linh để chữa đau nhức xương khớp, ăn uống không tiêu, đau dạ dày, mụn nhọt,…Các nghiên cứu hiện đại về Thổ phục linh cũng đã chỉ ra được nhiều tác dụng sinh học đáng kể của vị thuốc này như: chống viêm, chống oxy hoá, kháng khuẩn, hạ đường huyết… 2 Để góp phần nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của Thổ phục linh, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của phân đoạn dịch chiết n-hexan từ rễ củ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall. ex Roxb.)” với mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu thành phần hoá học có trong phân đoạn dịch chiết n-hexan rễ củ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall. ex Roxb.) 2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzymα-glucosidase của các chất phân lập được. [...]... cứu 2.2.1 Nghi n cứu về thành ph n hoá học có trong ph n đo n dịch chiết nhexan từ rễ củ Thổ phục linh 2.2.2 Thử hoạt tính ức ch enzym α- glucosidase của các chất ph n lập được (thử in vitro) 2.3 Phương pháp nghi n cứu 2.3.1.Phương pháp chiết Phương pháp chiết r n- lỏng: Sử dụng dung môi hữu cơ có di n hoà tan rộng để chiết các chất hữu cơ có trong mẫu c n ph n tích Dùng kỹ thuật chiết ngâm d n kết hợp... (không có chất nghi n cứu, có enzym -glucosidase và p-NPG) B: Mật độ quang trung bình của mẫu trắng (chỉ có dung dịch p-NPG) C: Mật độ quang trung bình của mẫu thử 3.3.2 Kết quả Kết quả sàng lọc các dịch chiết cho thấy dịch chiết c n có tác dụng ức chế 32% ở n ng độ thử 100 µg/mL, trong khi đó dịch chiết ph n đo n n- hexan có 26 tác dụng mạnh h n (41 %) Dựa theo kết quả n y, chúng tôi lựa ch n ph n đo n. .. tr n 10 giờ Thổ phục linh có khả n ng chống viêm do ức chế quá trình s n xuất các chất trung gian gây viêm như: NO, IL-6, TNF-α[12,16] Tác dụng chống oxy hóa: Theo nghi n cứu của Chuan-li-Lu và cộng sự, Thổ phục linh chứa phenonic, đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa tốt h n acid ascorbic trong thử nghiệm in vitro, có khả n ng quét gốc tự do (DPPH và ABTS) Khả n ng quét gốc DPPH của dịch chiết. .. n n  S n xuất: Công ty cổ ph n dược phẩm Á Âu  Thành ph n: Sói rừng (sarcandae), L-carnitine fumarate 50mg, Thổ phục linh (smilax) , Hoàng bá (cortex phellodendri), Nhàu (morinda citrifolia), Nhũ hương (boswella), Bạchthược (peony alba)  Nghệ ho n linh:  S n xuất: Công ty cổ ph n Dưỡng dược Bảo Sinh  Thành ph n: Thổ phục linh, Thi n ni n ki n, Nghệ vàng, Hoắc hương, Dạ cẩm, Vi lượng (Sắt, Kẽm, Calci,... chiết n- hexan, cô quay dưới áp suất giảm thu được 7,5g cặnn -hexan C n n -hexan được ph n tách tr n cột sắc ký pha thường với hệ dung môi n- hexan- aceton có gradient n ng độaceton từ 0 đ n 100% thể tích,thu được 7 ph n đo n nhỏ từ F1-F7 Ph n đo n F5 tiếp tục chạy sắc ký cột pha đảo RP18, hệ dung môi acetonnước tỷ lệ 5/1v/v Khảo sát các ph n đo n thu được bằng SKLM, các ph n đo n giống nhau gộp chung lại,... bệnh giang mai [2] Đã có nhiều nghi n cứu về cây thổ phục linh ở tr n thế giới được công bố, cho thấy các tác dụng của thổ phục linh: 10 Dịch chiết ethanol 900 từ th n rễ Thổ phục linh có tác dụng hạ đường huyết tr n chuột nhắt trắng [6]  Tiêm dưới da: liều 100, 200mg/kg c n nặng, mức hạ đường huyết mạnh nhất vào giờ thứ 2 và kéo dài tr n 6h  Đường uống: mức hạ đường huyết mạnh nhất ở giờ thứ 8 và duy... ở nhiệt độ 500C trong 30 phút,ti n hành 3 l n mỗi l n 2 lítethanol Gộp các dịch chiết, đem loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 115g c n ethanol Ph n t n cặnethanol trong 1 lít n ớc, thêm 0,5 lít n- hexan, sau đó lắc cho 2 lớp dung dịch ph n t n đều vào nhau, để ph n lớp trong phễu chiết 2 giờ, thu riêng ph n n ớc và n- hexan Ph n n ớc chiết lặp lại với n- hexan 2 l n, mỗi l n 0,5 lít Gom dịch chiết. .. phương pháp siêu âm để rút ng n thời gian chiết Phương pháp chiết lỏng-lỏng: Sử dụng để chiết cao alcol thô ban đầu chứa các hợp chất hữu cơ từ ph n cực đ n không ph n cực thành các ph n đo n có tính ph n cực khác nhau Sự chiết dựa tr n sự hoà tan của các chất có độ ph n cực khác nhau trong các dung môi khác nhau, chất ph n cực mạnh tan tốt trong dung môi ph n cực mạnh;chất kém ph n cực tan tốt trong... thông qua con đường RAGE-ERK ½-NF-kB (receptor advanced glycation end-Extracellular regulated protein kinase ½ NF-kB)[13] Tác dụng tr n tế bào ung thư: ph n n i tr n bề mặt ph n đo n dịch chiết n ớc của SG có khả n ng thúc đẩy sự kết dính của các tế bào, ức chế ung thư xâm l n và di c n tr n các tế bào ung thư gan (HepG 2), tế bào ung thư vú (MDA-MB-23 1), tế bào ung thư bàng quang (T2 4) khi thử in vitro;... trường hợp điều trị dở dang Thời gian điều trị trung bình là 79 ngày, ng n nhất 23 ngày, dài nhất 118 ngày) Chữa viêm mủ da: Thổ phục linh (30g), Kim ng n (15g), Cam thảo (15g) Sắc uống [3] Chữa phong thấp, g n xương đau nhức, tê buốt :Thổ phục linh (20g), thi n ni n ki n (8g), đương quy (8g), Bạch chỉ (6g), Cốt toái bổ (10g) Sắc uống [3] Chữa giang mai :Thổ phục linh (40g), Hà thủ ô (16g), vỏ N c n c . n-hexan từ rễ củ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall. ex Roxb. ) với mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu thành phần hoá học có trong phân đoạn dịch chiết n-hexan rễ củ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall. ex. ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT n-HEXAN TỪ RỄ CỦ THỔ PHỤC LINH (Smilax glabra Wall. ex. phần nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của Thổ phục linh, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của phân đoạn dịch chiết n-hexan