BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM LÝ HÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC CÂY KIM NGÂN (LONICERA SPP.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM LÝ HÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC CÂY KIM NGÂN (LONICERA SPP.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS. TS. Trần Văn Ơn 2. DS. Nguyễn Thành Công Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật - Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Trần Văn Ơn, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này cũng như quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn Thực vật. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới: ThS. Nghiêm Đức Trọng, người thầy đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận này, và đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, cho tôi rất nhiều kinh nghiệm và bài học quí báu trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn. DS. Nguyễn Thành Công, người anh đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. TS. Hoàng Quỳnh Hoa, ThS. Phạm Hà Thanh Tùng, DS. Phạm Thị Linh Giang, DS. Nguyễn Thị Thùy Linh và tất cả các kỹ thuật viên bộ môn Thực Vật đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian qua. Các bạn sinh viên K65 và các em sinh viên khóa dưới cùng nghiên cứu khoa học tại bộ môn Thực Vật đã luôn hỗ trợ, động viên, giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học qua, cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi, động viên, giúp đỡ tôi. Hà Nội, Ngày 14 tháng 5 năm 2015 Phạm Lý Hà MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố chi Kim ngân (Lonicera L.) 2 1.2. Tính đa dạng các loài trong chi Lonicera ở Việt Nam 2 1.3. Thành phần hóa học 5 1.4. Tác dụng sinh học và công dụng 7 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1. Nguyên liệu, thiết bị 10 2.1.1. Nguyên liệu 10 2.1.2. Thiết bị, hóa chất 10 2.2. Nội dung nghiên cứu 11 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật 11 2.2.2. Nghiên cứu về hóa học 11 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.3.1. Nghiên cứu về thực vật 11 2.3.2. Sắc ký lớp mỏng 12 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 16 3.1. Đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu 16 3.2. Đặc điểm giải phẫu thân của các mẫu nghiên cứu 27 3.3. Đặc điểm giải phẫu lá của các mẫu nghiên cứu 32 3.4. Sắc ký lớp mỏng 38 BÀN LUẬN 46 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 49 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học Phụ lục 2: Giấy chứng nhận mã số tiêu bản DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ca. Khoảng CH 3 COOH Acid acetic DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV EtOAc Ethyl acetat HCOOH Acid formic HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao L. Lonicera R f Hệ số lưu SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TLC Thin Layer Chromatography TT Thuốc thử UV Ultraviolet UV 254 Đèn tử ngoại phát bước sóng 254 nm UV 366 Đèn tử ngoại phát bước sóng 366 nm UV 366 - TT Mẫu phun thuốc thử dưới đèn tử ngoại bước sóng 366 nm VIS Visible VIS - TT Mẫu phun thuốc thử dưới ảnh sáng thường DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái phân biệt 3 loài L. dasystyla, L. macrantha, L. reticulata 21 Bảng 3.2 Đặc điểm giải phẫu thân phân biệt 3 loài L. dasystyla, L. macrantha, L. reticulata 31 Bảng 3.3 Đặc điểm giải phẫu lá phân biệt 3 loài L. dasystyla, L. macrantha, L. reticulata 36 Bảng 3.4 Giá trị R f các vết đặc trưng của chi Lonicera với dịch chiết tổng 40 Bảng 3.5 Giá trị R f các vết đặc trưng của loài trong chi Lonicera với dịch chiết tổng 41 Bảng 3.6 Giá trị R f các vết đặc trưng của chi Lonicera với dịch chiết EtOAc 44 Bảng 3.7 Giá trị R f các vết đặc trưng của loài trong chi Lonicera với dịch chiết EtOAc 45 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất chính trong dược liệu Kim ngân hoa và Kim ngân cuộng. 6 Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái của Lonicera dasystyla Rehder 17 Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái của Lonicera macrantha (D. Don) Spreng. 19 Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái của Lonicera reticulata Champ. 20 Hình 3.4 So sánh đặc điểm hình thái cành non, cành trưởng thành, mặt trên và mặt dưới lá 3 loài Kim ngân 24 Hình 3.5 So sánh đặc điểm hình thái cuống lá, gốc lá, mép lá, ngọn lá của 3 loài Kim ngân 25 Hình 3.6 So sánh đặc điểm hình thái lá bắc, lá bắc con, bầu, cuống chung 2 hoa, hoa và đài hoa 3 loài Kim ngân 26 Hình 3.7 Cấu tạo giải phẫu thân Kim ngân vòi nhám (Lonicera dasystyla) 28 Hình 3.8 Cấu tạo giải phẫu thân Kim ngân hoa to (Lonicera macrantha) 29 Hình 3.9 Cấu tạo giải phẫu thân Kim ngân mạng (Lonicera reticulata) 30 Hình 3.10 Cấu tạo giải phẫu lá Kim ngân vòi nhám (Lonicera dasystyla) 33 Hình 3.11 Cấu tạo giải phẫu lá Kim ngân hoa to (Lonicera macrantha) 34 Hình 3.12 Cấu tạo giải phẫu lá Kim ngân mạng (Lonicera reticulata) 35 Hình 3.13 Sắc ký đồ của dịch chiết tổng các mẫu Kim ngân dưới đèn UV 254 nm; pha động: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13) 38 Hình 3.14 Sắc ký đồ của dịch chiết tổng các mẫu Kim ngân dưới đèn UV 366 nm; pha động: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13) 38 Hình 3.15 Sắc ký đồ của dịch chiết tổng các mẫu Kim ngân dưới đèn UV 366 nm sau khi phun thuốc thử Vanilin/ acid sulphuric; pha động: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13) 39 Hình 3.16 Sắc ký đồ của dịch chiết tổng các mẫu Kim ngân dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử Vanilin/ acid sulphuric; pha động: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13) 39 Hình 3.17 Sắc ký đồ của dịch chiết EtOAc các mẫu Kim ngân dưới đèn UV 254 nm; pha động: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13) 42 Hình 3.18 Sắc ký đồ của dịch chiết EtOAc các mẫu Kim ngân dưới đèn UV 366 nm; pha động: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13) 42 Hình 3.19 Sắc ký đồ của dịch chiết EtOAc các mẫu Kim ngân dưới đèn UV 366 nm sau khi phun thuốc thử Vanilin/ acid sulphuric; pha động: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13) 43 Hình 3.20 Sắc ký đồ của dịch chiết EtOAc các mẫu Kim ngân dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử Vanilin/ acid sulphuric; pha động: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 13) 44 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kim ngân từ lâu đã được biết đến như một vị thuốc được dùng để chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, dị ứng. Bộ phận dùng là hoa, cành, lá. Vị thuốc Kim ngân có mặt trong rất nhiều bài thuốc dân gian và Y học cổ truyền, có thể kể đến một số bài thuốc cổ như: Ngân kiều tán, Ngũ vị tiêu độc ẩm, Tiên phương hoạt mệnh ẩm [12]. Y học hiện đại cũng đã có nhiều nghiên cứu chứng minh các tác dụng của Kim ngân trên mô hình in vitro và in vivo như: tác dụng kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa, kháng virus [9], [11], [12], [24], [39]. Nhờ áp dụng những tri thức dân gian và Y học cổ truyền vào sản xuất các dạng bào chế hiện đại, nhiều sản phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm đã được phát triển từ các bài thuốc có Kim ngân. Tuy nhiên, chi Kim ngân (Lonicera) rất đa dạng về loài. Trên thế giới, chi Lonicera (thuộc họ Cơm cháy (Caprifoliaceae) có khoảng 80 loài, ở Việt Nam có khoảng 10 loài [1], [2], [3], [32]. Sự đa dạng này dẫn đến khó khăn trong việc chuẩn hóa nguồn dược liệu, kể cả thu hái, trồng trọt với mục đích có năng suất, chất lượng cao. Vì vậy trên thực tế, có nhiều loài Kim ngân được sử dụng lẫn mà chưa được xác minh tên khoa học, nguồn gốc, chất lượng. Điều này ảnh hưởng lớn đến cả chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng cũng như lợi ích kinh tế cho các công ty sản xuất sản phẩm chăm sóc sức khoẻ có nguồn gốc từ Kim ngân. Từ thực tế trên, để góp phần nâng cao giá trị sử dụng và tiêu chuẩn hóa dược liệu Kim ngân, đề tài "Nghiên cứu đa dạng sinh học cây Kim ngân (Lonicera spp.)" được thực hiện với các mục tiêu: - Phân biệt một số loài thuộc chi Kim ngân (Lonicera) dựa trên đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu. - Xác định, so sánh sắc ký đồ dịch chiết các loài Kim ngân bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. [...]... Danguy); Kim ngân lẫn, Kim ngân núi (Lonicera confusa DC .), Kim ngân dại, Kim ngân vòi nhám (Lonicera dasystyla Rehd .); Kim ngân, Nhẫn đông (Lonicera japonica Thunb .); Kim ngân quả to, Kim 3 ngân Hildebrandia (Lonicera hildebrandia Coll et Hemsl .); Kim ngân mốc (Lonicera hypoglauca Miq .); Kim ngân hoa to, Kim ngân lông (Lonicera macrantha (D Don) Spreng .) [6], [10], [12] 1.2.1 Kim ngân trung bộ (Lonicera. .. Bắc Giang, Hà Tây (c ), Hòa Bình, Thái Bình, Hà Bắc, Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Kon Tum…[2], [3], [6], [12] 1.2 Tính đa dạng các loài trong chi Lonicera L ở Việt Nam Có 10 loài Kim ngân đã được xác định tìm thấy ở Việt Nam bao gồm: Kim ngân trung bộ (Lonicera annamensis Fukuoka); Kim ngân nhọn (Lonicera acuminata Wall in Roxb .); Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl .); Kim ngân lông (Lonicera cambodiana... phân bố chi Kim ngân (Lonicera L .) Vị trí phân loại của chi Kim ngân theo hệ thống phân loại của A Takhtajan: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân Lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Tục Đoạn (Dipsacales) Họ Kim ngân (Caprifoliaceae) Chi Kim ngân (Lonicera) Dây leo thân quấn Cành màu nâu đỏ Lá hình bầu dục dài Cụm hoa xim Hoa màu trắng, sau chuyển sang vàng nên gọi là Kim Ngân Quả hình... hình thái, giám định tên khoa học 3 mẫu Kim ngân - Mô tả đặc điểm vi phẫu thân và lá của 3 mẫu Kim ngân 2.2.2 Nghiên cứu về hóa học - Khảo sát tìm hệ dung môi pha động để tiến hành TLC với dịch chiết hoa, cành, lá Kim ngân - So sánh thành phần hóa học trong dịch chiết hoa, cành, lá Kim ngân dựa trên SKLM 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 2.3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái Phân... Các loài Kim ngân đã nghiên cứu có khá nhiều đặc điểm khác nhau về hình thái: Thân (đường kính, bề mặt, màu sắc), lá (hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt), lá bắc và lá bắc con (kích thước, bề mặt), cuống chung 2 hoa (chiều dài, bề mặt), đài hoa (hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt), tràng hoa (kích thước, tỷ lệ các phần, bề mặt), vòi nhụy (hình dạng, bề mặt, kích thước), bầu (màu sắc), chỉ nhị... Kim ngân đã được nghiên cứu từ khá sớm trên thế giới Theo Thang Đằng Hán, hoạt chất của Kim ngân là một chất có trạng thái dầu, không bay hơi, có thể tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ [12] Nhiều nghiên cứu về Kim ngân đã được tiến hành cả trong và ngoài nước Kết quả cho thấy các thành phần chính trong dược liệu Kim ngân hoa và Kim ngân cuộng bao gồm: 6 Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số... liệu Nguyên liệu nghiên cứu hình thái và giải phẫu là 3 mẫu Kim ngân tươi bao gồm cành, lá hoa có nguồn gốc từ 3 tỉnh khác nhau: Hà Nội (Vườn Thực Vật Trường ĐH Dược Hà Nội), Lào Cai (xã Tả Phìn, Huyện Sa Pa - 201 4), Hà Giang (xã Quản Bạ, Huyện Quản B ) (lần lượt kí hiệu KN01, KN02, KN0 3) Các mẫu được làm tiêu bản và lưu trữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP) Mã số tiêu bản... 1.2.5 Kim ngân lẫn, Kim ngân núi (Lonicera confusa DC .) Cây leo 2-4m Cành có lông hơi xám Lá có lông, phiến lá hình trái xoan, dài 4-6cm, rộng 1,5-3cm, tròn hay gần hình tim ở gốc, nhọn hay gần nhọn ở đầu, nhẵn 4 ở mặt trên, có lông mặt dưới Cụm hoa xim hai hoa ở nách các lá ở ngọn Hoa dài 1,6-2cm, lúc đầu trắng sau chuyển sang màu vàng Ra hoa tháng 6-9, quả tháng 10-11 [6] 1.2.6 Kim ngân dại, Kim ngân. .. công dụng 1.4.1 Tác dụng sinh học Kim Ngân đã được nghiên cứu khá kỹ về các tác dụng phòng và điều trị bệnh Các tác dụng có thể kể đến như: Tác dụng kháng khuẩn: Người ta nhận thấy nước sắc hoa Kim ngân có tác dụng mạnh đối với tụ cầu khuẩn, vi khuẩn thương hàn, trùng lỵ Shiga Nước sắc có tác dụng mạnh hơn các dạng bào chế khác Năm 1950, Lưu Quốc Thanh (Trung Hoa tân y học báo) [12] đã báo cáo dùng nước... mỏng Silicagel GF254 (Merck) 11 - Dụng cụ thủy tinh: pipet, cốc có mỏ, ống đong, bình chạy sắc kí, bình gạn, 2.1.2.2 Hóa chất - Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu: Javen, acid acetic, xanh methylen, Đỏ son phèn, glycerin - Nghiên cứu hóa học: Methanol, Ethyl acetat, Toluen, acid acetic, acid formic, cloroform, acid sulfuric đặc, ethanol, vanilin 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu về thực vật - Mô tả, . Danguy); Kim ngân lẫn, Kim ngân núi (Lonicera confusa DC .), Kim ngân dại, Kim ngân vòi nhám (Lonicera dasystyla Rehd .); Kim ngân, Nhẫn đông (Lonicera japonica Thunb .); Kim ngân quả to, Kim 3. nguồn gốc từ Kim ngân. Từ thực tế trên, để góp phần nâng cao giá trị sử dụng và tiêu chuẩn hóa dược liệu Kim ngân, đề tài " ;Nghiên cứu đa dạng sinh học cây Kim ngân (Lonicera spp. )& quot; được. Việt Nam bao gồm: Kim ngân trung bộ (Lonicera annamensis Fukuoka); Kim ngân nhọn (Lonicera acuminata Wall. in Roxb .); Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl .); Kim ngân lông (Lonicera cambodiana