BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LUYẾN XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LUYẾN XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS Nguyễn Tường Vy 2. Ths. NCS Cao Công Khánh HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ về mọi mặt từ các thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Nguyễn Tường Vy – Phó Trưởng Phòng SĐH- ĐH Dược Hà Nội Th.S NCS Cao Công Khánh – Viện KN ATVSTPQG đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này. Đồng thời tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Kiểm Nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã luôn sẵn lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực nghiệm. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 08 năm 2014 Tác giả Bùi Thị Luyến MỤC LỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH Đặt vấn đề 1 Chương 1. TỔNG QUAN 1 1.1. Vài nét về Quinolon 3 1.1.1. Cấu tạo chung 3 1.1.2. Phân loại 3 1.1.3. Cơ chế tác dụng 3 1.1.4. Tác dụng phụ 3 1.1.5. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu 4 1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký 5 1.3. Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm 12 1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi 12 1.3.2. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước 13 1.3.3. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở ngoài nước 14 1.3.4. Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm 16 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài 20 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 20 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 20 2.2.2. Thuốc thử, hóa chất 20 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1. Nghiên cứu các điều kiện LC-MS/MS 20 2.3.2. Nghiên cứu và lựa chọn quy trình xử lý mẫu 22 2.3.3. Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng 24 2.3.4. Thực nghiệm xác định quinolon trên mẫu thịt, cá 24 2.4. Tính toán kết quả, xử lí số liệu 25 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả khảo sát và lựa chọn các thông số cho LC-MS 27 3.1.1. Xác định các thông số của detector khối phổ (MS 27 3.1.2. Xác định các thông số của phần LC để tách các chất nhóm Quinolon 28 3.2. Xác định kỹ thuật xử lý mẫu 29 3.2.1. Quy trình tách chiết các chất cần phân tích khỏi nền mẫu 29 3.2.2. Quy trình làm sạch và làm giàu mẫu qua SPE 31 3.2.3. Quy trình xử lí mẫu được lựa chọn 33 3.3. Thẩm định phương pháp đã xây dựng 34 3.3.1. Tính thích hợp của hệ thống 34 3.3.2. Độ đặc hiệu/độ chọn lọc 35 3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 35 3.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 39 3.3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 39 3.4. Phân tích trên mẫu thực nghiệm 44 Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật 46 4.1.1. Các điều kiện phân tích trên hệ thống LC-MS/MS 46 4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu 47 4.2. Thẩm định quy trình đã xây dựng 47 Kết luận 50 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-MS/MS Liquid Chromatograph Tandem Mass Spectrometer Sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử EU European Union Liên minh Châu Âu APCI Atmospheric pressure chemical ionization ion hoá hoá học áp suất khí quyển AOAC Association of Official Analytical. Chemists Hiệp hội các nhà hoá phân tích IS Internal Standard Nội chuẩn Mẫu PT Mẫu phân tích TL Thịt lợn TG Thịt gà C01 Cá 01 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Ppb Part per billion Phần tỷ Ppm Part per million Phần triệu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số 2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu……………………………………………………….………… …15 Bảng 1.2 : Danh mục các quinolone hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản ……………………………… ………………………………… ….………….16 Bảng 3.1. Thông số chung của detector khối phổ………… ……… 27 Bảng 3.2 Thông số chi tiết của 4 Quinolon……………………… …………………27 Bảng 3.3 Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry……………….… ……….28 Bảng 3.4 Gradient pha động khi sử dụng cột Xbridge……… ……………… … 28 Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Norfloxacin…… 29 Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Ciprofloxacin… 30 Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Enrofloxacin …30 Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Flumequin.… ….30 Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin……… ……….31 Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Ciprofloxacin…… ….…… 32 Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Enrofloxacin……… ………32 Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Flumequin ………… …… 33 Bảng 3.13. Kết quả phân tích tính thích hợp của hệ thống……… ………………… 34 Bảng 3.14: Kết quả phân tích dãy chuẩn Norfloxacin………………….…………… 36 Bảng 3.15: Kết quả phân tích dãy chuẩn Ciprofloxacin……………… ……………37 Bảng 3.16: Kết quả phân tích dãy chuẩn Enrofloxacin……… ………………… …37 Bảng 3.17: Kết quả phân tích dãy chuẩn Flumequin…………………………….……38 Bảng 3.18: LOD và LOQ của các chất phân tích tính trên nền mẫu thịt……… ……39 Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Norfloxacin……… ……40 Bảng 3.20: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Ciprofloxacin…… …….40 Bảng 3.21: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Enrofloxacin……… ….41 Bảng 3.22: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Flumequin ……….…….41 Bảng 3.23: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18 của Norfloxacin…….……… 42 Bảng 3.24: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Ciprofloxacin…………42 Bảng 3.25: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Enrofloxacin…….…….41 Bảng 3.26: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Flumequin.…… …….41 Bảng 3.27 : Kết quả phân tích 20 mẫu thịt gà (đơn vị là µg/kg)…… ………… …44 Bảng 3.28: Kết quả phân tích 20 mẫu thịt lợn (đơn vị là µg/kg)……………… … 44 Bảng 3.29: Kết quả phân tích 20 mẫu cá nước ngọt (đơn vị là µg/kg)…………… 44 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon ………………………………… …….3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin ……………… …………………… 4 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin ……….………….…….…… ……….5 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Norfloxacin ….…………………………………… 5 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Flumequin …….……………………………………5 Hình 3.1: Sắc ký đồ thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích norfloxacin…… 29 Hình 3.2: Sắc ký đồ thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin…………………32 Hình 3.3: Sắc ký đồ khi phân tích tính thích hợp của hệ thống……………… ….35 Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn của Norfloxacin (trái) và Ciprofloxacin (phải)……….36 Hình 3.5: Sắc ký đồ khi xây dựng đường chuẩn của norfloxacin…………………….37 Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn của Enrofloxacin (trái) và Flumequin (phải)… …… 38 Hình 3.7: sắc ký đồ của norfloxacin khi xử lí mẫu qua cột SPE HLB …………… 40 Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu thực tế có (hoặc không có) norfloxacin……………… 45 1 ĐẶT VẤN ĐỀ An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ sức khoẻ con người. Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh học. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh nói chung và nhóm Fluoroquinolon nói riêng có thể làm nguồn thực phẩm cung cấp cho con người còn chứa một lượng nhỏ chất kháng sinh, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ. Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được mở rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản. Tuy nhiên, do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường xuất nhập khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao. Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam trên thị trường thế giới và sức khỏe người tiêu dùng. Quinolon có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử dụng rộng rãi để chữa bệnh cho người, gia cầm và thủy sản trong công nghiệp. Trong quá trình nuôi dưỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời gian sản xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lượng Quinolon còn lại trong thịt gia cầm hay thủy sản. Điều này sẽ gây rất nhiều mối nguy hiểm. Đặc biệt là gây ra hiện tượng kháng thuốc của một số vi khuẩn như: Salmonella, Campylobacter spp, Escherichia coli, Hậu quả là giảm hiệu quả của Quinolon đối với các chủng vi khuẩn trên, gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho con người. Để bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng, ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng thuốc trong nguồn thực phẩm khi cung cấp cho con người vào năm 1990. Theo sự kiểm tra và định hướng của các chuyên gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EC in 1996” [23] , trong đó quy định rõ hàm lượng kháng sinh theo từng loại thực phẩm và từng loại thuốc, ví dụ như với enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Mỹ, Hoa kỳ và các nước Bắc Mỹ đã [...]... tài: Xây dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC- MS/ MS”, với 2 mục tiêu chính như sau: 1 Xây dựng quy trình xác định dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin , flumequin trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép 2 lần khổi phổ LC- MS/ MS 2 Ứng dụng quy trình đã xây dựng để sơ bộ khảo sát dư lượng Quinolon trong một số loại thực phẩm (Thịt,... về các kỹ thuật xử lý mẫu với các đối tượng khác nhau và các kỹ thuật phân tích trên các loại hiết bị khác nhau nhằm xây dựng được quy trình kỹ thuật xác định dư lượng kháng sinh nhóm Quinolon trong thực phẩm phù hợp với điều kiện Việt Nam 1.3 Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm 1.3.1 Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Trong những năm gần đây, kháng sinh được sử dụng nhiều trong. .. 1.3.4 Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm EU đã ban hành quy t định số 2377/90/EC quy định qui định giới hạn cho phép thuốc thú y trong sản phẩm động vật, theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật phải được kiểm soát dư lượng tuân thủ qui trình của Chỉ thị số 96/23 EC (EU, 1996) Đặc biệt các phương pháp phân tích được công nhận và áp dụng trong chiến lược kiểm soát dư lượng. .. Fluoroquinolon Bộ Thủy sản đã ra quy t định số 07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005 quy định danh mục 17 loại kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong đó có nhóm Quinolon [10] và Quy t định số 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bổ sung nhóm Quinolon vào danh mục cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trường Bắc Mỹ và Hoa Kỳ [11] Vì vậy chúng tôi thực. .. hiệu năng cao (HPLC) với phổ khối lượng (MS) Trong nhiều quá trình phân tích, các hợp chất quan tâm thường nằm trong một hỗn hợp phức tạp, và vai trò của kỹ thuật sắc ký là thiết lập sự tách các thành phần của hỗn hợp, cho phép định tính hoặc định lượng chúng Về mặt định tính, nhược điểm chính của kỹ thuật sắc ký trong quá trình tách là không có khả năng cung cấp thông tin về định tính một cách rõ ràng... ngẫu nhiên tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội và xử lí mẫu theo các quy trình đã được nghiên cứu, lựa chọn ở trên Phân tích các mẫu trên hệ thống LC- MS/ MS với các điều kiện xác định Tính toán kết quả phân tích được đưa ra các nhận xét, đánh giá sơ bộ về phương pháp phân tích và tình hình tồn dư một số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm trên thị trường Hà Nội 2.4 Tính toán kết quả, xử lí số liệu Sử dụng... chọn quy trình xử lý mẫu a Nghiên cứu và lựa chọn các điều kiện chiết mẫu Sử dụng các nền mẫu trắng có thêm chuẩn ở nồng độ xác định và các điều kiện phân tích bằng LC- MS/ MS đã lựa chọn được ở trên, tiến hành thử nghiệm và xác định được quy trình và các điều kiện chiết mẫu phù hợp với từng đối tượng mẫu: - Thử nghiệm kỹ thuật chiết: lỏng-lỏng, rắn–lỏng, - Thử nghiệm và lựa chọn dung môi chiết mẫu, số. .. phải chuẩn hoá theo quy t định số 2002/657/CE (CE, 2002) Trong đó, quy định về giới hạn tồn dư tối đa của các quinolon trong nghiên cứu cụ thể như sau Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quy t định số 2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [22] Hoạt chất Định lượng chất tồn dư Cơ quan Bò, cừu, dê, lợn Danofloxacin Loài Thịt Mỡ Gan Thận Sữa Thịt Danofloxacin 16 Giới hạn tồn dư tối đa (MRL) (µg/kg)... quá 2ml/phút Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml methanol Rửa giải lấy chất phân tích bằng 2 x 2ml NH3 5%/ACN 23 2.3.3 Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng a Xác định độ chọn lọc/độ đặc hiệu Trên hệ thống LC- MS/ MS, với mỗi chất phân tích lựa chọn được ít nhất 01 ion mẹ và 02 ion con, một ion con để định lượng, một ion con để định tính Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu dung dịch chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn... này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắnphá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa Ion phân tử và các ion mảnh là các phần tử có khối lượng Nếu gọi khối lượng của một ion là m và điện tích của nó là e thì tỷ số z=m/e được gọi là số khối Hiển nhiên các ion có khối lượng là m, 2m, 3m… và điện tích tương ứng bằng e, 2e, 3e, … có số khối z bằng nhau Ion phân tử có số khối ký hiệu . DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LUYẾN XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT LC -MS/ MS. dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC -MS/ MS , với 2 mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng quy trình xác định dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin,. , flumequin trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép 2 lần khổi phổ LC -MS/ MS. 2. Ứng dụng quy trình đã xây dựng để sơ bộ khảo sát dư lượng Quinolon trong một số loại thực phẩm (Thịt,