BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN KHẮC TÙNG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO ĐẶC CHIẾT XUẤT TỪ VANG NHO, TRẦN BÌ VÀ CHÈ XANH LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN KHẮC TÙNG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO ĐẶC CHIẾT XUẤT TỪ VANG NHO, TRẦN BÌ VÀ CHÈ XANH LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Đức Toàn PGS.TS. Nguyễn Tường Vy HÀ NỘI, NĂM 2014 Lời cảm ơn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đức Toàn- Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế và PGS.TS Nguyễn Tường Vy, Trường đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tôi với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Hoá phân tích và các bộ môn khác của Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này. Luận văn này được thực hiện tại Khoa Vật lý đo lường- Viện Kiểm nghiệm- Bộ Y tế, dưới sự quan tâm hướng dẫn và giúp đỡ tận tình, vô tư của các anh chị và các bạn trong Khoa. Tôi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán bộ Khoa Vật lý đo lường. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, TS. Trần Việt Hùng và các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ cùng tôi trong cuộc sống và sự nghiệp. Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2014. DS. Nguy ễ n Kh ắ c Tùng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tiêu chuẩn chất lượng thuốc 2 1.1.1. Khái niệm 2 1.1.2. Các cấp tiêu chuẩn chất lượng của thuốc 2 1.1.3. Nguyên tắc, căn cứ xây dựng tiêu chuẩn 3 1.1.4. Nội dung chính một tiêu chuẩn chất lượng về thuốc 3 1.1.4.1. Yêu cầu kỹ thuật 3 1.1.4.2. Phương pháp thử 4 1.1.4.3. Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản, hạn dùng 4 1.1.5. Thẩm định phương pháp phân tích 4 1.1.5.1. Tính đặc hiệu (specificity, selectivity) 5 1.1.5.2. Tính tuyến tính (linearity) 6 1.1.5.3. Khoảng xác định 6 1.1.5.4. Độ đúng (accuracy) 7 1.1.5.5. Độ chính xác (precision) 7 1.1.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD) 8 1.1.5.7. Giới hạn định lượng (LOQ) 9 1.2. Cao thuốc và tiêu chuẩn chất lượng cao đặc 10 1.2.1. Định nghĩa 10 1.2.2. Yêu cầu chất lượng cao đặc 10 1.3. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu của đề tài 11 1.3.1. Nho và chiết xuất vang nho 11 1.3.2. Trần bì và chiết xuất trần bì 13 1.3.3. Chè xanh và chiết xuất chè xanh 19 1.4. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 22 1.4.1. Phương pháp xử lý mẫu 22 1.4.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 23 1.4.2.1. Khái niệm 23 1.4.2.2. Pha tĩnh 23 1.4.2.3. Pha động 23 1.4.2.4. Detector dùng trong HPLC 24 1.4.2.5. Các thông số đặc trưng của HPLC 25 1.4.3. Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất trong cao 28 1.4.3.1. Phương pháp phân tích resveratrol 28 1.4.3.2. Phương pháp phân tích hesperidin 29 1.4.3.3. Phương pháp phân tích epigallocatechin gallat 31 1.4.3.4. Phương pháp phân tích đồng thời resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat 32 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Đối tượng nghiên cứu 34 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 34 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ 34 2.2.2. Hóa chất, thuốc thử 35 2.3. Phương pháp nghiên cứu 35 2.3.1. Xác định một số chỉ tiêu chất lượng chung của cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 35 2.3.2. Xây dựng, thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat bằng HPLC 37 2.3.2.1. Xây dựng phương pháp 37 2.3.2.2. Thẩm định phương pháp 38 2.3.2.4. Định tính, định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 39 2.4. Tính toán kết quả và xử lý số liệu 40 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42 3.1. Xác định các chỉ tiêu chất lượng chung của cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 42 3.1.1. Tính chất cảm quan 42 3.1.2. Tro toàn phần 42 3.1.3. Xác định giới hạn kim loại nặng trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 43 3.2. Định tính, định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh bằng HPLC 44 3.2.1. Xây dựng phương pháp 44 3.2.1.1. Chuẩn bị mẫu 44 3.2.1.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện 45 3.2.1.3. Lựa chọn cột sắc ký 47 3.2.1.4. Lựa chọn pha động 47 3.2.2. Thẩm định phương pháp 49 3.2.2.1. Khảo sát tính tương thích của hệ thống 49 3.2.2.2. Khảo sát tính đặc hiệu 50 3.2.2.3. Tính tuyến tính 51 3.2.2.4. Độ lặp lại 54 3.2.2.5. Độ đúng 55 3.2.2.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 56 3.2.3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính, định lượng resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 57 3.2.3.1. Định tính 57 3.2.3.2. Định lượng 60 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 61 4.1. Về đối tượng nghiên cứu 61 4.2. Về phương pháp nghiên cứu 62 4.3. Về kết quả nghiên cứu 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 * KẾT LUẬN 65 * KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN CĐ Acetonitril Cao đặc DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV DMF Dimethylformamide DMSO Dimethyl sulfoxide ĐL Định lượng ĐT Định tính EGCG Epigallocatechingallat HDL High densitylipoprotein HES Hesperidin HPLC Sắc k ý lỏng hiệu năng cao ICH International Conference on Harmonisation KL Khối lượng LDL Low densitylipoprotein LOD Limit of detection LOQ Limit of quantitation MeOH Methanol PDAD Detector dãy diod quang RES Resveratrol RSD Relative Standard Deviation SKS số kiểm soát TLTK TFA Tài liệu tham khảo Acid trifloroacetic UV-Vis Ultraviolet- visible VKNTW Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các yếu tố cần được đánh giá đối với một phương pháp phân tích 5 Bảng 1.2. Đặc điểm một số dung môi thường dùng trong HPLC 24 Bảng 3.1. Tính chất cảm quan của cao đặc 42 Bảng 3.2. Xác định độ tro toàn phần của cao đặc 43 Bảng 3.5. Kết quả xác định khoảng tuyến tính 52 Bảng 3.6. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 54 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 55 Bảng 3.8. Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với epigallocatechin gallat 56 Bảng 3.9. Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với hesperidin 56 Bảng 3.10. Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với resveratrol 57 Bảng 3.11. Kết quả định lượng resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong các mẫu cao nghiên cứu. 60 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Nho (Vitis sp). 11 Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của resveratrol. 12 Hình 1.3. Quả quýt và dược liệu trần bì. 13 Hình 1.4.Cấu trúc cơ bản các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus. 15 Hình 1.5. Cấu trúc hoá học của hesperidin. 15 Hình 1.6. Sơ đồ chiết xuất citroflavonoid 18 Hình 1.7. Chè xanh (Camellia sinensis) 19 Hình 1.8. Cấu trúc các polyphenol chính trong chè xanh [37]. 20 Hình 1.9. Sắc ký đồ và các thông số đặc trưng. 26 Hình 2.1. Máy HPLC – UV 34 Hình 3.1. Phổ tử ngoại của epigallocatechin gallat trong methanol 46 Hình 3.2. Phổ tử ngoại của hesperidin trong methanol 46 Hình 3.3. Phổ tử ngoại của resveratrol trong methanol 46 Hình 3.4. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp với tỷ lệ pha động (20: 80). 48 Hình 3.5. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp với tỷ lệ pha động (30: 70). 48 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu. 51 (A): mẫu trắng; (B): chuẩn hỗn hợp; (C): mẫu thử cao đặc hỗn hợp. 51 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của epigallocatechin gallat 52 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của hesperidin 53 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của resveratrol 54 Hình 3.10. Sắc đồ định tính mẫu thử 58 Hình 3.11. Phổ UV-Vis của resveratrol. (A) chuẩn, (B) thử. 59 Hình 3.12. Phổ UV-Vis của hesperidin. (A) chuẩn, (B) thử. 59 Hình 3.13. Phổ UV-Vis của epigallocatechin gallat. (A) chuẩn, (B) thử. 60 [...]... "Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc chiết xuất từ vang nho, trần bì và chè xanh" để góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm trong đề tài trên của Viện Kiểm nghiệmthuốc Trung ương Đề tài thực hiện với hai mục tiêu: 1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất trong cao 2 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tiêu chuẩn chất lượng... một dẫn xuất thảo dược từ lá chè xanh (Camellia sinensis) Thành phần của chiết xuất chè xanh rất giàu các chất chống oxy hoá, chủ yếu là các catechin Cao mềm chè xanh thu được từ việc cô đặc dịch chiết lá chè xanh trong dung dịch ethanol (2%, kl/kl) đến độ ẩm khoảng 20 đến 25% Hàm lượng catechin trong cao mềm chè xanh vào khoảng (20% ,kl/kl) [32] Cao khô chè xanh thu được từ dịch chiết chè xanh trong... tiêu chuẩn chất lượng thuốc đã được Bộ Y tế xem xét và các chỉ tiêu chất lượng bổ sung khác [5] 1.1.3 Nguyên tắc, căn cứ xây dựng tiêu chuẩn - Dựa trên tiến bộ khoa học và công nghệ, kinh nghiệm thực tiễn, yêu cầu về quản lý chất lượng và đảm bảo chất lượng thuốc và xu hướng phát triển kinh tế- xã hội - Sử dụng tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nước ngoài làm cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn. .. để xây dựng tiêu chuẩn và quy chuẩn kỹ thuật, trừ trường hợp các tiêu chuẩn đó không phù hợp với đặc điểm về địa lý, khí hậu, kỹ thuật, công nghệ của Việt Nam - Bảo đảm tính thống nhất của hệ thống tiêu chuẩn và hệ thống quy chuẩn kỹ thuật của Việt Nam [11] - Căn cứ xây dựng tiêu chuẩn + Tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nước ngoài, + Kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ... [7] 1.1.2 Các cấp tiêu chuẩn chất lượng của thuốc Tiêu chuẩn chất lượng thuốc của Việt Nam bao gồm tiêu chuẩn quốc gia và tiêu chuẩn cơ sở - Tiêu chuẩn quốc gia (TCVN) về chất lượng thuốc và các phương pháp kiểm nghiệm thuốc được quy định tại Dược điển Việt Nam - Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) do cơ sở sản xuất thuốc xây dựng và công bố TCCS không được thấp hơn TCVN về chất lượng thuốc Tiêu chuẩn chất lượng... công nghệ chiết tách resveratrol từ nguồn thực vật Việt Nam [13] 1.3.2 Trần bì và chiết xuất trần bì - Trần bì là vỏ quả chín phơi hay sấy khô của quả Quýt, có tên khoa học là Citrus reticulate Blanco, họ cam (Rutaceae) Hình 1.3: Quả quýt và dược liệu trần bì Những nghiên cứu khoa học cho thấy dược liệu trần bì có các nhóm thành phần hoạt chất: 13 Carotenoid: Các chất sắc tố từ vàng đến đỏ cam và tan... 2, 3 Sấy chân không Sản phẩm Hình 1.6: Sơ đồ chiết xuất citroflavonoid 18 1.3.3 Chè xanh và chiết xuất chè xanh - Chè xanh (Camellia sinensis) Cây chè hay cây trà có tên khoa học là Camellia sinensis thuộc họ Theaceae Hình 1.7: Chè xanh (Camellia sinensis) Ở Việt Nam, hàng trăm năm nay, cây chè vẫn được coi là một cây trồng truyền thống, mang tính đặc sản Chè được trồng khắp nơi ở Việt Nam, nhất là... chế từ chiết xuất của các dược liệu trên Vấn đề đặt ra là muốn cho sản phẩm tạo thành có chất lượng tốt, ổn định và có thể vươn ra thế giới trong điều kiện kinh tế hội nhập thì sản phẩm phải có quy định về các đặc tính kỹ thuật và yêu cầu quản lý dùng làm chuẩn đánh giá sản phẩm Chính vì vậy, yêu cầu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm là rất quan trọng Chúng tôi thực hiện đề tài "Bước đầu xây. .. dược liệu nho, trần bì, chè xanh đã được các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới nghiên cứu rất nhiều về tác dụng dược lý,các nghiên cứu này đã chứng minh được tác dụng chống oxy hoá và ngăn ngừa xơ vữa động mạch của nho, trần bì, chè xanh là rất tốt Để tạo ra tác dụng hiệp đồng của các dược liệu trên, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương - Bộ Y tế đề xuất đề tài nghiên cứu bào chế và đánh giá... độ lệch chuẩn của đáp ứng của chất phân tích có nồng độ gần LOD; S là độ dốc của đường chuẩn của chất phân tích ở khoảng nồng độ gần LOD 9 1.2 Cao thuốc và tiêu chuẩn chất lượng cao đặc 1.2.1 Định nghĩa Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp Các dược liệu trước khi chiết xuất được . trọng. Chúng tôi thực hiện đề tài " ;Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc chiết xuất từ vang nho, trần bì và chè xanh& quot; để góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm trong đề. gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 43 3.2. Định tính, định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN KHẮC TÙNG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO ĐẶC CHIẾT XUẤT TỪ VANG NHO, TRẦN BÌ VÀ CHÈ XANH LUẬN