1 LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ - Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và phòng miễn dịch học thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Đỗ Ngọc Liên giảng viên cao cấp khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đã giao đề tài, tận tình giúp đỡ, động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập, cũng như chỉ bảo, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ - Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các cán bộ và các em học viên – Phòng Miễn dịch học của Trung tâm nghiên cứu khoa học Sự sống , Trường Đại học khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn quan tâm, chăm sóc, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc. Xin trân trọng cảm ơn ! Hà nội, ngày tháng năm 2011 Học viên Phí Thị Phượng 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của GS. TS . Đỗ Ngọc Liên. Luận văn này không có sự trùng lặp với các đề tài khác. Hà nội, ngày tháng năm 2011 Học viên Phí Thị Phượng 3 MC LC M U 1 Nội dung 5 Chơng 1. tổng quan tài liệu 5 1.1. Cây quất cảnh 5 1.1.1. Đặc điểm sinh học, phân bố 5 1.1.2. Thành phần hóa học 6 1.1.3. Công dụng của cây quất 6 1.2. Hợp chất phenolic 6 1.2.1. Phân loại và vai trò của hợp chất phenolic trong thực vật 6 1.2.2. Flavonoid thực vật 8 1.2.3. Tannin 11 1.2.4. Alkaloid 13 1.3. BNH I THO NG (T) 14 1.3.1. Khỏi nim 14 1.3.2. Tiờu chun chn oỏn T 15 1.3.3. Phõn loi v c ch sinh bnh ca T 16 1.3.4. Tỡnh hỡnh bnh T trờn th gii 19 1.4. BNH BẫO PHè 20 1.4.1. Khỏi nim v phõn loi bnh bộo phỡ 20 1.4.2. Thc trng bộo phỡ trờn th gii v Vit Nam 21 1.4.3. Nguyờn nhõn gõy ra bộo phỡ 21 1.4.4. Tỏc hi ca bnh bộo phỡ 22 1.4.5. Ri lon trao i lipid mỏu 23 1.4.6. Mi quan h gia bộo phỡ vi ỏi thỏo ng 24 4 1.5 . CC THUC IU TR I THO NG 25 1.5.1. T theo quan nim ca Y hc c truyn 25 1.5.2. T vi y hc hin i 26 Chơng 2 : đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 28 2.1. Đối tợng nghiên cứu 28 2.1.1. Nguyên liệu thực vật 28 2.1.2 Nguyên liệu động vật 28 2.1.3. Dụng cụ, hoá chất thí nghiệm 30 2.2. Phơng pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Phơng pháp chiết cao tổng số và các phân đoạn hợp chất tự nhiên 31 2.2.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của vỏ quả quất cảnh 32 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đờng huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh 36 2.2.4. Phơng pháp xử lý số liệu thống kê 40 CHƯƠNG 3: KếT QUả Và THảO LUậN 41 3.1. QUY TRèNH TCH CHIT CC PHN ON T V QU QUT CNH 41 3.2. NH TNH MT S HP CHT T NHIấN TRONG CC PHN ON DCH CHIT CA V QU QUT CNH Fortunella japonia(Thunb) Swingle 43 3.3. định lợng hợp chất polyphenol tổng số theo phơng pháp folin ciocalteau 44 3.4. phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên của quả quất bằng Sắc ký lớp mỏng 45 3.5. KT QU TH C TNH LD 50 THEO NG UNG 48 3.6. KT QU GY Mễ HèNH CHUT BẫO PHè THC NGHIM 49 3.7. Xây dựng mô hình chuột ĐTĐ ( Type 2) thực nghiệm 54 5 3.8. TÁC ĐỘNG CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CỦA VỎ QUẢ QUẤT CẢNH ĐẾN KHẢ NĂNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT Ở CHUỘT ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 58 3.8.1 T¸c dông cña c¸c ph©n ®o¹n dÞch chiÕt lªn chuét tiªm STZ sau 10h ®iÒu trÞ 58 3.8.2. T¸c dông cña c¸c ph©n ®o¹n dÞch chiÕt lªn chuét §T§ type 2 sau 21 ngµy ®iÒu trÞ 60 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 6 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại BMI của người châu Âu và người châu Á 20 Bảng 2.1. Thành phần thức ăn nuôi chuột béo phì 29 Bảng 2.2. Kết quả xây dựng đồ thị chuẩn acid gallic 35 Bảng 2.3. Điều trị chuột ĐTĐ bằng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả quất cảnh 38 Bảng 3.1. Hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ vỏ quả quất cảnh 42 Bảng 3.2. Thành phần một số hợp chất tự nhiên trong các dịch chiết vỏ quả Cây quất cảnh(Fortunella japonia Thunb 43 Bảng 3.3. Hàm lượng hợp chất polyphenol tổng số trong các chế phẩm từ vỏ quả Cây quất cảnh 45 Bảng 3.4. Đặc điểm các băng vạch của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả quất trên sắc ký đồ 47 Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính theo đường uống 48 Bảng 3.6. Trọng lượng tính theo (g) của các lô chuột sau 6 tuần tiến hành gây mô hình béo phì thực nghiệm 50 Bảng 3.7. Một số chỉ số hoá sinh của chuột bình thường và chuột béo phì sau 6 tuần nuôi ở hai chế độ ăn khác nhau 52 Bảng 3.8. Nồng độ glucose huyết(mmol/l) của chuột trước và sau khi tiêm STZ 55 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến nồng độ glucose huyết(mmol/l) của chuột ĐTĐ type 2 59 Bảng 3.10. Nồng độ glucose huyết ( mmol/l) của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị 61 7 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây quất cảnh( Fortunella japonia Thunb 5 Hình1.2. Flavan ( 2-phenyl chroman) 8 Hình 1.3. Rutin và saponin 9 Hình 1.4. Càein và nicotin 13 Hình 2.1. Chuột nhắt trắng Mus musculus chủng Swiss 29 Hình 2.2. Máy đo đường huyết tự động One touch Ultra2 30 Hình 2.3. Streptozotocin 31 Hình 2.4. Kết quả xây dựng đồ thị chuẩn acid gallic 35 Hình 3.1. Quy trình tách chiết các hợp chất tự nhiên từ vỏ quả quất cảnh 41 Hình 3.2. Sắc ký đồ các dịch chiết quả quất trên bản mỏng silicagel, hiện màu bằng H2SO4 10% 46 Hình 3.3. Chuột bình thường và chuột béo sau 6 tuần nuôi 49 Hình 3.4. Biểu đồ về sự tăng trọng lượng của chuột nuôi ở 2 chế độ khác nhau sau 6 tuần nuôi 50 Hình 3.5. Biểu đồ về một số chỉ số hoá sinh giữa chuột thường và chuột béo phì 52 Hình 3.6. Biểu đồ về chỉ số lipase (U/l) giữa chuột thường và chuột béo phì 53 Hình 3.7. Biểu đồ nồng độ glucose huyết của các lô chuột trước tiêm và sau 72h tiêm 55 Hình 3.8. Biểu đồ sự thay đổi nồng độ glucose huyết ở chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống các phân đoạn dịch chiết vỏ quả quất cảnh 10h 59 Hình 3.9. Sự thay đổi nồng độ glucose huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả quất cảnh 61 8 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BMI Chỉ số khối cơ thể ( Body Mass Index) BPTN Béo phì thực nghiệm CHCl 3 Chloroform ĐC Đối chứng ĐT Điều trị ĐTĐ Đái tháo đường EtOAc Ethylacetat HDL - c High density lipoprotein – cholesterol ( Lipoprotein tỷ trọng cao) HFD Thức ăn có hàm lượng chất béo cao ( High Fat Diet) KĐT Không điều trị LDL – c Low denstity lipoprotein-cholesterol( Lipoprotein tỷ trọng thấp) MeOH Methanol Met Metformin ND Thức ăn chuẩn ( Normal Diet) PĐ Phân đoạn TG Triglycerid TC Cholesterol toàn phần WHO Tổ chức y tế thế giới (Wold Health Organization) 9 M U 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là nớc nhiệt đới có đặc điểm khí hậu đa dạng, có nguồn tài nguyên sinh vật nói chung, nguồn tài nguyên thực vật nói riêng rất phong phú. Việt Nam lại có nền Y dợc học cổ truyền dân tộc lâu đời. Từ lâu nhân dân ta đã biết sử dụng cây cỏ có sẵn xung quanh nh là một nguồn dợc liệu để chữa bệnh. Ngày nay, trong thời kỳ công nghiệp hoá, hiện đại hoá đất nớc, một trong những nhiệm vụ cơ bản là phải đảm bảo sự phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên của đất nớc. Một trong những nguồn lợi thiên nhiên đó là nguồn các hợp chất tự nhiên, chúng đợc sử dụng làm nguyên liệu trong nhiều lĩnh vực công nhiệp: thực phẩm, mỹ phẩm, dợc liệu và nhiều mặt hàng có giá trị xuất khẩu khác. Chính vì vậy, trong những năm gần đây, việc nghiên cứu, khai thác, và ứng dụng các hợp chất tự nhiên vào các lĩnh vực khác nhau của cuộc sống đang là hớng nghiên cứu đợc nhiều ngời quan tâm, đặc biệt là trong lĩnh vực Y - dợc học. [31], [32],[ 54] Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, các hợp chất polyphenol (một nhóm các hợp chất tự nhiên) có hoạt tính dợc học đang ngày càng đợc ứng dụng rộng rãi trong việc điều trị nhiều loại bệnh nh: kháng khuẩn chống ung th, viêm gan Ngoài ra chúng còn có tác dụng chữa một số bệnh về rối loạn trao đổi lipid - glucid và béo phì, một căn bệnh phổ biến và nguy hiểm ngày nay. [23] Y dợc học hiện đại ngày nay đã có nhiều loại thuốc chống béo phì và rối loạn trao đổi lipid - glucide nh: Sibutramine, Orlistat, Metforminđợc 10 điều trị béo phì và đáI tháo đờng ( ĐTĐ). Tuy nhiên, hầu hết các loại thuốc tân dợc này đều có thể có tác dụng phụ nguy hiểm, cha kể tới việc hiện nay trên thị trờng có nhiều loại thuốc đợc quảng cáo là có tác dụng chống béo phì song những loại thuốc này đều không có cơ sở khoa học. WHO Tổ chức y tế thế giới ( Wold Health Organization) cũng đã khuyến cáo nên nghiên cứu phát triển các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dợc, đặc biệt là ở các nớc nhiệt đới có tài nguyên thực vật phong, phú nền kinh tế đang phát triển vì nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và ít tác dụng phụ.[23], [31], [32], [44], [54] Cây quất cảnh Fortunella japonia (Thunb) đợc trồng rộng rãi ở nớc ta, đặc biệt là vào dịp Tết Nguyên Đán. Nhân dân ta từ lâu đã biết sử dụng quất trong các bài thuốc để chữa nhiều loại bệnh, trong đó có những bài thuốc có tác dụng chống bệnh béo phì rất hiệu quả. Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật cho biết, ăn quất cả vỏ sẽ cho vitamin C, chất xơ rất có lợi cho tiêu hóa và hạ đợc cholesterol, làm vững chắc thành mạch, chữa bệnh tăng huyết áp. Tuy vậy, tác dụng chống béo phì của nó ít thấy đợc ghi nhận trong các tài liệu nghiên cứu sinh dợc học.[2], [5] Từ những thực tế nêu trên, nhằm góp phần tìm kiếm và nghiên cứu thuốc điều trị béo phì và rối loạn trao đổi lipid - glucid, tìm hiểu thành phần hoá học cơ bản của quả quất chúng tôi thực hiện đề tài mang tên: " Nghiên cứu tác dụng hạ đờng huyết của dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh Fortunella japonia (Thunb) Swingle trên mô hình chuột thực nghiệm " 2. Mục đích nghiên cứu. Nghiên cứu đặc tính sinh dợc học của một số hợp chất tự nhiên từ dịch vỏ quả quất cảnh (Fortunella japonia (Thunb) Swingle) với tác động chính là hạ đờng huyết trên mô hình chuột ĐTĐ thực nghiệm nhằm tạo cơ sở cho [...]... nhiên từ dịch chiết vỏ quả quất cảnh bằng kỹ thuột sắc ký lớp mỏng và định lượng flavonoid tổng số từ các phân đoạn dịch chiêt - Xác định độc tính LD50 của phân đoạn dịch cồn tổng số ( cồn 90%) - Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh trên mô hình chuột thực nghiệm ĐTĐ typ2 4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu. .. trình tách chiết có hiệu quả các phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ vỏ quả quất cảnh - Phân lập một số hợp chất bằng sắc ký mỏng, định tính, định lượng một số hợp chất tự nhiên từ vỏ quả quất cảnh - Đánh giá được tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh Fortunella japonia lên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 12 13 Nội dung Chương 1 tổng quan tài liệu 1.1 Cây quất cảnh. .. chế từ thực phẩm giầu chất béo theo tiêu chuẩn của viện Dinh dưỡng Quốc gia và theo phương pháp của Soon et al, 2002 [ 56], Srinivasan et al, 2005[57] 4.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết (cao ethanol, n- hexan, clorofom, ethlaxetate,) từ vỏ quả quất cảnh Fortunella japonia trên mô hình chuột đã gây ĐTĐ phỏng theo type 2.[45],[57] 5 Phương pháp nghiên. ..những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ĐTĐ ở người 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Dựa trên mục đích nghiên cứu chúng tôi xác định các nhiệm vụ cụ thể của luận văn như sau: - Định tính một số hợp chất tự nhiên trong các dịch chiết vỏ quả quất cảnh bằng một số phản ứng định tính đặc trưng của các phân đoạn dịch chiết theo quy trình tách chiết đã lựa chọn... tinh dầu, dịch quả có chứa đường và các acid hữu cơ Quả quất giàu pectin, vitamin C (tỷ lệ 0,13 0.24 mg) Người ta đã tách và xác định được thành phần một số chất chứa trong tinh dầu quất như: linonene (9 3,73%), myrcene (1 ,84%), ethylacetate (1 ,13%) Ngoài ra còn một số chất như camphene, terpinen-4-ol, citronellyl formate, citronellyl acetate [5], [10] 1.1.3 Công dụng của cây quất Nhân dân ta từ xưa đã... nghiên cứu 5.1 Phương pháp định tính thành phần hoá học của vỏ quả quất cảnh 5.2 Định lượng hợp chất phenolics tổng số theo phương pháp Folin Ciocalteau 5.3 Phương pháp phân lập các hợp chất bằng kỹ thuật sắc kí lớp mỏng 5.4 Xây dựng mô hình chuột thí nghiệm - Chuột béo phì thực nghiệm, ĐTĐ type 2 5.5 Phương pháp định lượng một số chỉ số hóa sinh 5 6 Phương pháp xử lý thống kê 6 Đóng góp mới của đề... cộng sự đã tiến hành thí nghiệm trên những con chuột đồng được vỗ béo bằng một chế độ dinh dưỡng giàu cholesterol, rồi cho chúng hấp thu chất polymethoxylated flavones (PMF) ( thực chất là những yếu tố chống oxy hoá tích cực thuộc nhóm flavonoid) tách từ vỏ quả cam, quất, quýt Kết quả cho thấy chỉ 1% PMF trong khẩu phần ăn hàng ngày cũng làm giảm tới 40% lượng cholesterol độc hại LDL nguyên nhân gây... tượng nghiên cứu * Mẫu thực vật - Quả quất cảnh được TS Trn Vn n i hc Dc H Ni phân loại và theo mô tả của TS Võ Văn Chi [2] - Thời gian thu hái: vào tháng 12 năm 2010, tại vườn quất Tứ Liên thuộc huyện Từ Liêm - Hà Nội *Mẫu động vật - Chuột nhắt trắng chủng Swiss (1 4 15g) 4 tuần tuổi được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW * Mẫu thức ăn - Thức ăn tiêu chuẩn được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW 11 - Thức... hoặc trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin Vai trò của hợp chất phenolic trong thực vật Hợp chất phenolic có ở hầu hết các bộ phận của cây đặc biệt là tế bào thực vật quang hợp Chúng được hình thành từ những sản phẩm của quá trình đường phân và con đường pentose qua cynamic acid hay theo con đường acetate... và alkaloid do tạo tủa với chúng - Tannin có tác dụng chống ung thư do có khả năng kết hợp với các chất gây ung thư 21 - Tannin ở nồng độ cao ức chế hoạt động của các enzyme nhưng ở nồng độ thấp chúng thường kích hoạt enzyme - Tannin có tác dụng ức chế và diệt khuẩn, tác dụng cầm máu do làm se hệ mao mạch hay tác dụng làm giảm đau tại chỗ do làm giảm tác dụng ở đầu dây thần kinh trung ương [24] 1.2.4 . bản của quả quất chúng tôi thực hiện đề tài mang tên: " Nghiên cứu tác dụng hạ đờng huyết của dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh Fortunella japonia (Thunb) Swingle trên mô hình chuột thực nghiệm. đích nghiên cứu. Nghiên cứu đặc tính sinh dợc học của một số hợp chất tự nhiên từ dịch vỏ quả quất cảnh (Fortunella japonia (Thunb) Swingle) với tác động chính là hạ đờng huyết trên mô hình chuột. 90 %). - Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh trên mô hình chuột thực nghiệm ĐTĐ typ2 4. Đối tợng và phạm vi nghiên cứu