- 1 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 - - -  - - - TRẦN TRUNG KIÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH, TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ HAI LOÀI Ipomoea batatas L. VÀ Ipomoea cairica L. LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2009 TRẦN TRUNG KIÊN NGÀNH: SINH HỌC KHÓA 2006 - 2009 - 2 - MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Béo phì và đái tháo đường (ĐTĐ) là các bệnh rối loạn chuyển hóa – nội tiết. Béo phì, theo tổ chức y tế thế giới WHO là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe như: bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tiểu đường, đột quỵ, giảm khả năng sinh sản, giảm chức năng hô hấp, tăng viêm xương khớp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa. Đái tháo đường với biểu hiện chung nhất là tăng glucose huyết hay tăng đường huyết do tế bào β của đảo tụy Langerhan bị phá hủy mất khả năng sản xuất insulin (ĐTĐ typ 1) hoặc do rối loạn trao đổi chất lipid – glucid dẫn đến đối kháng insulin (ĐTĐ typ 2). Đái tháo đường và béo phì là hai biểu hiện bệnh thường có mối quan hệ bệnh lý khá chặt chẽ với nhau. Cùng với bệnh tim mạch và ung thư, đái tháo đường thực sự trở thành mối lo ngại đáng báo động trên toàn thế giới. Ở Việt Nam, các số liệu thống kê gần đây cho thấy đái tháo đường là bệnh thường gặp và có tỉ lệ tử vong cao nhất trong các bệnh nội tiết. Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa có hệ thực vật phong phú, đa dạng, có nhiều loại cỏ cây cho những vị thuốc quý. Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và ứng dụng trong y dược của một số loại cây là cần thiết. Việc sử dụng các loại thuốc tân dược thường có tác dụng phụ không mong muốn và thường đắt tiền. Các loại thuốc dược liệu từ cây cỏ thường ít gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng của thuốc kéo dài. Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lý, hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt. Trên cơ sở kết quả - 3 - nghiên cứu của M.Yoshimoto và cộng sự (2004) về tác động hạ glucose huyết của lá khoai lang (Ipomoea batatas L.) trên mô hình chuột nhắt gây bệnh bằng STZ [42]. Chính vì vậy tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh, tác dụng hạ đường huyết của một số hợp chất tự nhiên từ hai loài Ipomoea batatas L. và Ipomoea cairica L.”. 2. Mục đích nghiên cứu 1. Nghiên cứu một số thành phần hóa sinh của hai loài Ipomoea batatas L. và Ipomoea cairica L 2. Tác dụng hạ đường huyết của một số hợp chất tự nhiên trên mô hình chuột béo phì và đái tháo đường typ 2. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Để thực hiện mục tiêu trên, chúng tô i tiến hành những nội dung sau: 1. Tách chiết các hợp chất tự nhiên bằng cách sử dụng các loạ i dung môi hữu cơ chiết qua các phân đoạn. 2. Định tính các hợp chất tự nhiên bằng các phản ứng đặc trưng. 3. Định lượng theo phương pháp Folin – Ciocalteau. 4. Phân lập một số hợp chất từ hai loà I Ipomoea batatas L. và Ipomoea cairica L. bằng kĩ thuật sắc kí lớp mỏng. 5. Thiết kế mô hình chuột bị bệnh béo phì và đá i tháo đường typ 2. 6. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết, các chỉ tiê u mỡ máu trên chuột bị bệnh béo phì và đái tháo đường thực nghiệm. 4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 4.1. Mẫu thực vật - 4 - Mẫu thực vật của hai loài Ipomoea batatas L. và Ipomoea cairica L., mọc phổ biến ở vùng trung du Bắc Bộ. Được TS. Trần Văn Ơn, trường ĐH Dược Hà Nội giám định tên khoa học. 4.2. Mẫu động vật Chuột nhắt chủng Swiss nặng từ 14 – 16g, mua tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương. 4.3. Phạm vi nghiên cứu Chỉ tiến hành trên đối tượng là rau Khoai lang, lá Bìm bìm và mô hình thực nghiệm chuột béo phì, đái tháo đường typ 2. 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1. Định tính thành phần hóa học của các hợp chất tự nhiên từ hai loài Ipomoea batatas L. và Ipomoea cairica L. 5.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp quang phổ Folin – Ciocalteau (Phương pháp Orthofer etal, 1999) 5.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và chống béo phì của dịch chiết một trong hai loài là ngọn rau Khoai lang (Ipomoea batatas L.) hoặc lá Bìm bìm (Ipomoea cairica L.) 5.4. Phương pháp phân lập các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng. 6. Giả thuyết khoa học Sau khi thực nghiệm, chúng tôi dự kiến sẽ đưa ra những đóng góp mới sau: 1. Đưa ra qui trình tách, chiết một số hợp chất tự nhiên bằng cách sử dụng các dung môi hữu cơ tách qua các phân đoạn. 2. Phân lập một số hợp chất từ hai loài Ipomoea batatas L. và Ipomoea cairica L. - 5 - 3. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết, các chỉ tiêu mỡ máu trên chuột bị bệnh béo phì và đái tháo đường thực nghiệm. - 6 - NỘI DUNG Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY KHOAI LANG ĐỎ (Ipomoea batatas L.) VÀ CÂY BÌM BÌM (Ipomoea cairica L.) 1.1.1. Cây Khoai lang (Ipomoea batatas (L.)) [9] 1.1.1.1. Thực vật học Khoai lang còn gọi là cam chư, phan chư, cam thự, hồng thự, có tên khoa học là Ipomoea batatas L. Lam., thuộc họ Khoai lang Convolvulaceae, là cây thảo sống lâu năm, có thân mọc bò, dài 2-3m. Rễ phình thành củ tròn dài, màu đỏ, trắng hay vàng. Lá có nhiều hình dạng, hình tim xẻ ba hoặc năm thùy, sâu hay cạn, có cuống dài. Hoa màu tím nhạt hay trắng, mọc thành xim ít hoa ở đầu cành hay nách lá. 1.1.1.2. Phân bố, sinh thái Nhờ tính thích nghi tương đối rộng, khoai lang được trồng khắp nơi trên thế giới, từ vĩ độ 0 - 45 0 Bắc và Nam. Các xứ trồng nhiều khoai lang gồm có: Trung Quốc, Indonesia, Nhật, Ấn Độ, Philippines, Brazil, Argentina, Mỹ, . . .Nhật Bản là nước trồng Khoai lang có năng suất ổn định và cao nhất. Tại đây Khoai lang được xem là cây lương thực quan trọng hàng thứ hai sau lúa gạo. Tại Hoa Kỳ, Khoai lang được trồng nhiều ở các tiểu bang phía nam, từ Bắc Carolina đến Texas và được xem là thức ăn chính của dân trong vùng [4]. Ở Việt Nam, tại các tỉnh phía Bắc, Khoai lang được trồng tập trung nhiều nhất tại Nghệ An, Hà Tĩnh, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, . . . Tại các tỉnh phía Nam, Khoai lang được trồng tập trung tại các tỉnh Quảng Nam - Đà Nẵng, và rải rác tại Quảng Ngãi, Phan Rang, Phan Thiết và Đồng Nai. Tuy là loại hoa màu có nguồn gốc nhiệt đới (Nam Mỹ, Ấn Độ), Khoai lang vẫn có thể mọc được trên nhiều loại đất và khí hậu khác nhau. - 7 - Đất đai: Khoai lang có thể mọc được trên nhiều loại đất khác nhau từ sa cấu cát đến sét nặng. Tuy nhiên loại đất thích hợp nhất vẫn là đất xốp dễ thoát nước, có sa cấu từ cát đến thịt pha cát và phải màu mỡ. Khoai lang là cây tương đối chịu mặn, pH thích hợp từ 4,2 - 8,3. Khí hậu: Khoai lang chịu lạnh kém, mọc tốt ở nhiệt độ tương đối ấm áp từ 15 - 35 0 C, có thể chịu được nhiệt độ lên đến 45 0 C. Vì vậy nó thích hợp ở vùng khí hậu nhiệt đới, cho củ phẩm chất tốt, ít sơ và ngọt. 1.1.1.3. Thành phần hóa học Củ Khoai lang chứa 24,6% tinh bột, 4,17% glucose. Khi còn tươi, củ chứa 1,3% protein, 0,1% chất béo, các diastase, tro có Mn, Ca, Cu, các vitamin A, B, C, 4,24% tanin, 1,375% pentosan. Khi đã phơi khô ở chỗ mát, trong củ có inosit, gôm, dextrin, acid chlorogenic, phytosterol, carotin, adenin, betain, cholin. Dây Khoai lang chứa adenin, betain, cholin. Ngọn dây Khoai lang có một chất gần giống insulin, ở lá già không có chất này. Lá chứa chất nhựa tẩy (1,95-1,97%) [4, 9]. 1.1.1.4. Một số tác dụng Sinh - Dược và công dụng của cây Khoai lang [42] Lá Khoai lang là một loại rau dân dã vừa ngon, vừa mát và bổ. Củ và rau Khoai lang là vị thuốc phòng và chữa bệnh đã được dùng từ lâu trong dân gian, có nơi gọi nó là "sâm nam". Củ Khoai lang có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bồi bổ cơ thể, ích khí, cường thận, kiện vị, tiêu viêm, thanh can, lợi mật, sáng mắt. Nó được dùng chữa vàng da, ung nhọt, viêm tuyến vú, phụ nữ kinh nguyệt không đều, nam giới di tinh, trẻ em cam tích, lỵ. Khoai lang là một loại thức ăn tốt cho bệnh nhân tiểu đường. Ngọn dây khoai lang đỏ có một chất gần giống insulin. Các nghiên cứu còn cho thấy, củ khoai lang chứa caiapo - một hợp chất giúp kiểm soát tốt lượng đường và - 8 - cholesterol trong máu người mắc tiểu đường type 2. Theo tiến sĩ Bemhard Luđvik thuộc đại học Vienna (Áo), caiapo là chất kiểm soát bệnh tiểu đường type 2 rất hiệu quả. Không một phản ứng phụ nào được ghi nhận ở những bệnh nhân được điều trị bằng chất này. Lượng cholesterol máu ở nhóm dùng caiapo cũng thấp hơn hẳn so với nhóm đối chứng [42]. Ngoài ra khoai lang còn dược dùng để chữa nhiều bệnh khác như: táo bón, thiếu sữa, tùy vị hư yếu, không muốn ăn uống, viêm dạ dày, tá tràng, 1.1.2. Cây Bìm bìm (Ipomoea cairica L.) [4, 9] 1.1.2.1. Thực vật học Cây Bìm bìm có tên khoa học Ipomoea cairica L. Sweet. Thuộc họ Khoai lang Convolvulaceae. Là loại cây leo, thân quấn. Thân cảnh mảnh, nhẵn, lá mọc so le, có 5 thùy xẻ sâu tới tận cuống lá, hình chân vịt, phiến lá mỏng, hình mác, đầu nhọn, hai mặt nhẵn, gân nổi rõ. Cuống lá dài 2-5cm, có năm lá nhỏ kèm theo do chồi nách sinh ra. Cụm hoa mọc ở kẽ lá, lưỡng phân. Hoa to, hình phễu, có màu trắng hoặc lam tím. Quả nang hình cầu. Cây ra hoa từ tháng 5 tới tháng 12. 1.1.2.2. Nơi sống và thu hái Bìm bìm là loài cổ nhiệt đới, thường mọc hoang ở nhiều nơi, mọc quấn vào hàng rào hoặc các bụi cây khác. Nhân dân các địa phương còn trồng cây này làm cảnh, trồng bờ rào, làm dàn che nắng. Thu hái toàn cây quanh năm. Rửa sạch, cắt ngắn từng đoạn, dùng tươi hay phơi khô. 1.1.2.3. Thành phần hóa học Hạt chứa một chất glucosid màu vàng nhạt là muricatin A có tính xổ, dầu béo 11,5%, một chất không xà phòng hóa chứa β-sitosterol. 1.1.2.4. Tính vị, tác dụng, công dụng Vị ngọt, tính hàn, hơi có độc, có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu. Rễ củ và thân có vị đắng. - 9 - Dân gian thường dùng lá đâm rịt trị bệnh đầu voi. ở Hawai, người ta dùng rễ củ và thân để ăn. Ở Ấn độ, người ta dùng lá giã ra xoa đắp trên cơ thể người bị ban; hạt được dùng làm thuốc xổ. Ở Trung quốc, người ta dùng trị: 1. Ho do bệnh về phổi; 2. Giảm niệu; đái ra máu; 3. Phù thũng. Dùng liều 5 – 12g dạng thuốc sắc. Không dùng cho người bị ốm, yếu. Dùng ngoài trị đinh nhọt, viêm mủ da, đòn ngã tổn thương, giã cây tươi đắp vào chỗ đau [4, 9]. Hiện nay chưa có tài liệu nghiên cứu về khả năng điều hòa lượng đường trong máu của các hợp chất từ cây Bìm bìm này. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN Ở THỰC VẬT 1.2.1. Hợp chất phenolic [18, 31] 1.2.1.1. Đặc điểm chung và phân loại Thuật ngữ “hợp chất phenolic” dùng để chỉ một nhóm hợp chất có cấu trúc vòng benzen, mang một hay nhiều nhóm thế hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen. Vì vậy còn gọi là hợp chất phenol. Trong tự nhiên, các hợp chất phenolic phân bố rất phổ biến trong thực vật, chúng thường tồn tại dưới dạng glycoside dễ tan trong nước và tập trung ở các không bào. Các hợp chất phenolic chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực vật, chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lí, sinh hóa quan trọng như: điều hòa quá trình trao đổi chất dưới những hình thức khác nhau, tham gia vào quá trình hô hấp như vận chuyển H + trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa… Dựa vào thành phần và cấu trúc, người ta phân hợp chất phenolic thành ba nhóm: hợp chất phenolic đơn giản, hợp chất phenolic phức tạp và nhóm hợp chất phenolic đa vòng (polyphenol). - Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: trong phân tử có một vòng benzen và một hay nhiều nhóm hydroxyl. Tùy thuộc vào số lượng nhóm hydroxyl mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquinon,…), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquinol,…). - 10 - - Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: trong thành phần cấu trúc phân tử của chúng ngoài vòng thơm benzen (C 6 ) còn có dị vòng, mạch nhánh. Nhóm này được phân thành: Nhóm C 6 – C 1 (acid phenol carbonic): cấu trúc phân tử có thêm nhóm carbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm. Nhóm C 6 – C 3 (acid coumaric, acid cafeic): có gốc carbonyl được nối với nhân benzen qua hai nguyên tử carbon, thường gặp ở thực vật bậc cao. Nhóm đa vòng C 6 – C 1 – C 6 (flavonoid): nhóm này rất đa dạng, cấu trúc phân tử gồm hai vòng benzen, một vòng pyran và được phân thành các nhóm phụ như: flavon, flavonol (sắc tố vàng), antoxyanidin (sắc tố xanh, đỏ, tím), catechin (không màu)… - Nhóm hợp chất phenolic polymer: được chia thành các nhóm phụ như: tanin, ligin, melanin, acid humic. 1.2.1.2. Vai trò của hợp chất phenolic trong thực vật [6, 29] Hợp chất phenolic có ở hầu hết các bộ phận của cây đặc biệt là ở tế bào thực vật quang hợp. Chúng được hình thành từ những sản phẩm của quá trình đường phân và con đường pentose qua acid cynamic hay theo con đường acetate malonate qua Acetyl – CoA. Nhóm hợp chất này có một số chức năng trong đời sống thực vật: - Các hợp chất phenolic tham gia vào quá trình hô hấp như là một chất vận chuyển hydro. - Các polyphenol có thể hình thành liên kết hydro với các protein và enzyme làm thay đổi hoạt động của các enzyme này tương tự như hiệu ứng dị lập thể. Nó làm tăng hoặc giảm hoạt động của enzyme. - Hợp chất phenol tác dụng mạnh lên quá trình sinh trưởng, đóng vai trò là chất hoạt hóa AIA – oxydase và tham gia vào quá trình sinh tổng hợp enzyme này. [...]... được một số kết quả Nguyễn Ngọc Xuân đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của Thổ phục linh (Smilax glabra) trên mô hình chuột gây ĐTĐ bởi STZ và chuột ĐTĐ type 2 do di truyền [14] Nguyễn Thị Thanh Ngân đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá Khế trên mô hình chuột gây ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ [11] Ngoài ra, còn rất nhiều các nghiên cứu trong và ngoài nước chứng minh tác dụng hạ đường. .. cấp xung huyết, tăng sự thẩm thấu của mao mạch, phù nề Một số flavonoid có tác dụng như vitamin P Các flavonoid có hoạt tính của vitamin P không chỉ có tác dụng lên tính chống chịu của mạch máu - 17 như làm tăng tính bền và đàn hồi của thành mạch, giảm sức thấm của mao mạch, mà còn có tác dụng đến biểu hiện lâm sàng khác như nhiễm độc, sốt, rối loạn hoạt động của hệ tim mạch * Flavonoid có tác dụng chống... sinh học của chúng Phản ứng xảy ra giữa nhóm OH và nhóm cacbonyl của các peptide để tạo thành liên kết hydro Do tính chất này mà flavonoid có thể tương tác với protein enzym làm thay đổi hoạt tính của nhiều enzym * Tác dụng làm bền thành mạch (hoạt tính của vitamin P) Trong tự nhiên cùng với sự tồn tại của vitamin C, có một số chất flavonoid có tác dụng hỗ trợ với vitamin C, thường được phối hợp trong... xạ, gốc tự do, các tác nhân gây đột biến và các chất gây oxy hóa Hàm lượng và thành phần các polyphenol phụ thuộc nhiều vào nhân tố sinh thái Ví dụ: trong điều kiện lạnh, cây tích lũy nhiều antoxyan xanh và tím Các flavonoid như flavon và antoxyan có vai trò trong điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp Một số hợp chất polyphenol tạo màu sắc tự nhiên của hoa... enzyme - 19 Tannin có tác dụng ức chế và diệt khuẩn, tác dụng cầm máu do làm se hệ mao mạch hay tác dụng làm giảm đau tại chỗ do làm giảm tác dụng ở đầu dây thần kinh trung ương 1.2.4 Alkaloid [6, 13, 18] 1.2.4.1 Khái niệm và phân loại Alkaloid là các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân chứa nitơ dị vòng, có đặc tính kiềm (alka - có tính kiềm), thường gặp ở thực vật và đôi khi cả ở động vật,... hoa Trong số các hợp chất polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng nhất vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính sinh – dược học 1.2.2 Flavonoid thực vật [10, 18] Flavonoid là một trong những nhóm polyphenol thường gặp trong thực vật và là những sắc tố phần lớn có màu vàng, dễ tan trong nước, do đó có tên flavonoid (flavus = màu vàng) Tuy nhiên một số sắc tố... 1.2.4 4 Tác dụng sinh học [18] Alkaloid được hình thành từ các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như: trao đổi protein Ở trong cây, alkaloid được coi như là chất dự trữ cho tổng hợp protein, các chất bảo vệ cây, tham gia vào sự chuyển hoá hydro ở các mức độ khác nhau, Alkaloid được sử dụng nhiều trong công nghiệp dược, có rất nhiều thuốc chữa bệnh được sử dụng trong y học là các alkaloid tự nhiên. .. các nhóm OH tự do trong cùng phân tử hoặc giữa các phân tử với nhau Đặc điểm này làm ảnh hưởng nhiều đến tính chất vật lý, hóa học như điểm sôi, điểm nóng chảy, độ hòa tan, đặc tính phổ tử ngoại, cấu trúc phân tử và cả khả năng phản ứng 1.2.2.4 Tác dụng sinh, dược học của flavonoid [5, 25, 31] * Tác dụng chống oxy hóa (antioxydant): Một trong những cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để flavonoid thể hiện... dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết hợp chất tự nhiên từ thực vật như thân và quả Mướp đắng (Momordica charantia) [8, 12], dây Đau xương (Tinospora sinensis) [27], Khế tàu (Averrhoa bilimbi) [32], dây Cóc (Tinospora crispa) [29], dây Thần thông (Tinospora cordifolia) [37, 40], Ba kích (Monnda offcinalis) [35] Cơ chế hạ đường huyết của chúng cũng đang được tìm hiểu Nghiên cứu cho thấy dịch... máu là tác nhân tiềm tàng gây ra sự đề kháng tác dụng của insulin của các tế bào cơ, làm giảm khả năng thu nạp glucose từ tuần hoàn máu của các tế bào cơ và gan dẫn đến rối loạn trao đổi glucid và biểu hiện là đái tháo đường typ 2 Bên cạnh đó, acid béo tự do còn làm thay đổi trạng thái bình thường của thụ thể insulin trên màng Như vậy, béo phì là yếu tố gây ra sự rối loạn trao đổi lipid được đặc trưng . Ipomoea batatas L. và Ipomoea cairica L.”. 2. Mục đích nghiên cứu 1. Nghiên cứu một số thành phần hóa sinh của hai loài Ipomoea batatas L. và Ipomoea cairica L 2. Tác dụng hạ đường huyết của một. batatas L .) trên mô hình chuột nhắt gây bệnh bằng STZ [42]. Chính vì vậy tôi chọn đề tài: Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh, tác dụng hạ đường huyết của một số hợp chất tự nhiên từ hai loài Ipomoea. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 - - -  - - - TRẦN TRUNG KIÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH, TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN