TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ DUNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELLULASE TRONG ĐẤT ĐỒI TẠI KHU VỰC XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ DUNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELLULASE TRONG ĐẤT ĐỒI TẠI KHU VỰC XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình sống và học tập tại Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 em đã nhận đƣợc sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các thầy cô trong trƣờng và các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN. Em cảm ơn thầy cô đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt 4 năm học vừa qua. Đặc biệt với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung ngƣời hƣớng dẫn trực tiếp em, đã tận tình hƣớng dẫn em thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật học đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian làm đề tài. Qua đây, em xin chân thành cảm ơn tất cả những ngƣời thân trong gia đình, bạn bè đã ủng hộ va động viên em hoàn thành tốt khóa luận. Do thời gian và điều kiện có hạn nên trong khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận đƣợc sự góp ý của các thầy cô cùng các bạn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Trần Thị Dung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp với đề tài “ Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn của cô giáo PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung. Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với công trình của các tác giả khác. Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Trần Thị Dung CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP : Diaminopimelic Acid CFU : Colony Forming Unit CMC : Cacboxyl methyl cellulose DNA : Deoxyribonucleic Acid HSCC : Hệ sợi cơ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh ISP : International Streptomyces Project RNA : Ribonucleic Acid rRAN : Riboxom Ribonucleic Acid m : meso PG : PeptidoGlycan VSV : Vi sinh vật MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 7. Điểm mới của đề tài 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 4 1.1.1. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 10 1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn 14 1.2.1. Cellulose 15 1.2.2. Cellulase 15 1.2.3. Hệ enzyme phân giải cellulose 16 1.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam và trên thế giới 17 1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose trên thế giới 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam 17 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật 20 2.1.1. Vi sinh vật 20 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 20 2.2. Môi trƣờng 20 2.2.1. Môi trƣờng phân lập 20 2.2.2. Môi trƣờng bảo quản và giữ giông 21 2.2.3. Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme 22 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 23 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất 23 2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống 25 2.3.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 25 2.3.5. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn 26 2.3.6. Phƣơng pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu. 27 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 28 3.1.1. Phân lập xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 28 3.1.2. Tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng sinh cellulase cao 38 3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử và tính chất nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 43 3.2.1. Cuống sinh bào tử và bào tử 43 3.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của 3 chủng xạ khuẩn tuyển chọn Đ3, Đ7, Đ9 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Bản đồ khu vực đất đồi Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc 23 Hình 2.2. Hình ảnh về pha loãng dịch huyền phù đất 24 Hình 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của xạ khuẩn, nấm mốc 31 Hình 3.4. Khuẩn lạc xạ khuẩn 32 Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn theo độ sâu 34 Hình 3.6. Một số chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi 35 Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 35 Hình 3.7. Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập 38 Hình 3.8. Hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn nghiên cứu 42 Hình 3.9. Hình ảnh hệ sợi, hình dạng tế bào và cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 45 Hình 3. 10. Hình thái chủng Đ3 46 Hình 3. 11. Hình thái chủng Đ7 47 Hình 3. 12. Hình thái chủng Đ9 48 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 30 Bảng 3.2. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo độ sâu 33 Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của 18 chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 36 Bảng 3.4. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 37 Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa CMC 39 Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa bột giấy 40 Bảng 3.7. Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 41 Bảng 3.8. Hình dạng cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn 44 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân huỷ cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Enzyme cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4-0-glycoside trong phân tử cellulose, olygosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác. Hiện nay việc sử dụng các enzyme nhƣ cellulase trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giấy sản xuất dung môi hữu cơ và đặc biệt trong xử lý rác thải hữu cơ là vấn đề đang đƣợc con ngƣời đặc biệt quan tâm. Rác thải ở Việt Nam đang là một hiện trạng đáng lo ngại. Cùng với sự phát triển kinh tế, gia tăng dân số cộng với sự lãng phí tài nguyên trong thói quen sinh hoạt của con ngƣời, rác thải hữu cơ có số lƣợng ngày càng tăng, tiềm ẩn ngày càng nhiều nguy cơ độc hại với môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đƣợc enzyme cellulase có nhiều khả năng và triển vọng giải quyết vấn đề nêu trên trong giám định và xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Chúng có thể hoạt động trên chất thải khó xử lý, làm thay đổi đặc tính của chất thải và đƣa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn. Enzyme cellulase đƣợc sinh tổng hợp bởi nhiều loài khác nhau nhƣ: các loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động vật nguyên sinh. Ngoài ra cellulase còn có ở các loài sinh vật khác nhƣ thực vật và động vật.Trong số các nhóm vi sinh vật nêu trên thì xạ khuẩn phân giải cellulose là một trong những đối tƣợng đã và đang đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Phƣờng Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có diện tích tự nhiên là 423,9 [...]... Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khu n có khả năng sinh cellulase cao trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập, tuyển chọn xạ khu n trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử và tính chất nuôi cấy của các chủng xạ khu n phân lập đƣợc 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Một số chủng. ..ha, trong đó đất diện tích đất đồi khá lớn Do vậy, việc khảo sát các chủng xạ khu n trong đất đồi có khả năng phân hủy cellulose cao là việc có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc cải tạo đất và bảo vệ môi trƣờng Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khu n có khả năng sinh enzyme cellulase trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc ... chế biến phân bón vi sinh 7 Điểm mới của đề tài Qua nghiên cứu, chúng tôi đã tuyển chọn đƣợc 3 chủng xạ khu n Đ3, Đ7, Đ9, có khả năng sinh cellulase cao trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm và phân loại xạ khu n Xạ khu n phân bố rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nƣớc, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khu n, ... Một số chủng xạ khu n có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 5 Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 5.2 Phƣơng pháp phân lập xạ khu n 5.3 Phƣơng pháp bảo quản chủng giống 5.4 Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khu n 5.5 Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khu n 5.6 Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả 2 6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn... Sự phân bố của xạ khu n phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác của thảm thực vật Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm xạ khu n, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [19] Sự phân bố của xạ khu n còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trƣờng Chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu 6,8 - 7,5 Xạ khu n có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc acid và. .. acid và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lƣợng xạ khu n cũng thay đổi theo thời gian trong năm Xạ khu n tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, nƣớc, dùng để sản xuất nhiều enzyme nhƣ protease, amylase, cellulase một số acid amin và acid hữu cơ Một số xạ khu n có thể gây bệnh cho ngƣời, động vật [4] 1.1.1 Một số phương pháp trong phân loại xạ khu n Cùng với sự... của hệ sợi xạ khu n là một trong những đặc điểm phân biệt khu n lạc của xạ khu n và khu n lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đƣờng kính rất lớn, thay đổi từ 5 – 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thƣờng Khu n lạc của xạ khu n thƣờng chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khu n lạc xạ khu n có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện... các quá trình phân giải hợp chất hữu cơ để làm giàu dinh dƣỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng 6.2 Ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn một số chủng xạ khu n có hoạt tính cellulase cao, ứng dụng các chủng xạ khu n này vào đời sống (trong chăn nuôi, môi trƣờng) Từ các chủng xạ khu n có hoạt tính cellulase cao này có thể tạo ra các chế phẩm vi sinh vật phục vụ cho việc xử lý rác thải (ủ rác thải sinh hoạt),... lớn xạ khu n là vi sinh vật hiếu khí, ƣa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển là 25- 300C Đa số xạ khu n phát triển tốt nhất trong môi trƣờng pH là 6,8 – 7, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trƣờng kiềm[18] Xạ khu n là nhóm vi khu n Gram (+), đặc biệt khác với các vi sinh vật khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao ( trên 70%), trong khi đó vi khu n khá thấp ( 25- 45%) Một. .. Việt nam là đất nƣớc sản xuất nông nghiệp là chủ yếu nên việc nghiên cứu về khả năng sinh enzyme cellulase của xạ khu n có triển vọng rất lớn 19 CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật 2.1.1 Vi sinh vật Các chủng xạ khu n phân lập đƣợc từ mẫu đất đồi tại phƣờng Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 2.1.2 Hóa chất và thiết bị Hóa chất: Giấy lọc, Cacboxyl methyl cellulose (CMC), thuốc thử . 3.1.1. Phân lập xạ khu n trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 28 3.1.2. Tuyển chọn xạ khu n trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng sinh cellulase cao. chọn một số chủng xạ khu n có khả năng sinh cellulase cao trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khu n trong đất đồi khu vực. tôi chọn đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khu n có khả năng sinh enzyme cellulase trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc . 2. Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn