1 ĐẶT VẤN ĐỀ Da quan lớn thể có chức bảo vệ Mặc dù gồm lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu nguyên bào sợi tế bào sừng nhƣng việc tái tạo da bị tổn thƣơng thách thức Các tế bào da nuôi cấy vật liệu tƣơng đƣơng da chế tạo từ tế bào da nuôi cấy đƣợc ứng dụng điều trị bỏng, vết thƣơng mạn tính … Việc khắc phục hạn chế đƣợc kỳ vọng vào vai trò tác dụng tế bào gốc chúng tế bào chƣa có chức chuyên biệt, chúng có tiềm phát triển thành nhiều loại tế bào khác có khả tự thay Tế bào gốc trung mô tồn tủy xƣơng, máu cuống rốn, dây rốn, mô liên kết thể khoảng kẽ nhiều quan Các tế bào đƣợc nuôi cấy nhân lên in vitro dƣới điều kiện thích hợp chúng cảm ứng biệt hóa thành tế bào xƣơng, sụn, mỡ Hiện nay, tế bào gốc trung mô đƣợc coi dạng tế bào quan trọng cho công nghệ mô Trong liền vết thƣơng, tế bào gốc trung mô đƣợc xác định chúng biệt hóa thành dạng tế bào da khác Tủy xƣơng nguồn tế bào gốc trung mô nhƣng vấn đề thu tủy xƣơng gặp khó khăn số lƣợng ngƣới cho tủy xƣơng hạn chế Những vấn đề cần cân nhắc hạn chế ứng dụng lâm sàng tế bào gốc trung mơ tủy xƣong Việc tìm kiếm tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đƣợc quan tâm nghiên cứu năm gần Dây rốn mơ mềm có chiều dài lớn cầu nối thai bánh để trao đổi oxy, dinh dƣỡng…cho thai Các nghiên cứu phôi thai học kháng nguyên bạch cầu ngƣời (Human Leukocyte Antigen – HLA) tế bào từ dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi khơng phải từ ngƣời mẹ Mô dây rốn sản phẩm thải sau sinh nguồn tƣơng đối dƣ thừa Sự thu hồi mô dễ dàng không bị ảnh hƣởng cúa vấn đề đạo đức luật pháp Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc từ màng dây rốn Các tế bào sau phân lập nuôi cấy trì, cấy chuyền đến lần mơi trƣờng ni cấy đặc trƣng chƣa bị biệt hố, giữ đƣợc đầy đủ đặc tính TBG ban đầu phân lập Từ sở lý luận thực tiễn nêu trên, đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mơ màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm” đƣợc tiến hành nhằm mục tiêu: Đánh giá số đặc điểm phân lập ni cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn Đánh giá hiệu ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn điều trị vết thƣơng bỏng nhiệt thực nghiệm Những đóng góp luận án: - Luận án có đóng góp cho nghiên cứu nghiên cứu thực nghiệm, phân lập đƣợc tế bào gốc trung mơ từ màng dây rốn ngƣời, đặc tính tế bào gốc trung mô ảnh hƣởng chúng vết thƣơng bỏng dị loại thỏ thực nghiệm - Mở hƣớng nghiên cứu lĩnh vực nuôi cấy tế bào để điều trị vết thƣơng bỏng, vết thƣơng mạn tính - Một số điểm thu đƣợc kết nghiên cứu luận án tế bào gốc trung mô phân lập từ màng dây rốn ngƣời mọc đơn lớp điều kiện nuôi cấy in vitro có khả tạo cụm, cụm tế bào gốc trung mô dạng CFU-F (Collony Forming Unit – Fibroblast) - Tế bào gốc trung mô màng dây rốn ngƣời có đặc tính sinh miễn dịch thấp Các tế bào có bộc lộ phân tử HLA-G HLA-E nhƣng bộc lộ HLADR, với mức độ thấp Kháng thể đặc hiệu kháng tế bào gốc trung mô thỏ xuất với hiệu giá thấp - Tế bào gốc trung mơ màng dây rốn cảm ứng để biệt hóa thành ngun bào sợi mơi trƣờng định hƣớng in vitro Bố cục luận án: Luận án gồm 119 trang với 29 hình ảnh, biểu đồ 22 bảng, đó: đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (30 trang); Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu (23 trang); Kết nghiên cứu (36); Bàn luận (25 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang) Tài liệu tham khảo: 145 tài liệu (tiếng Việt 29, tiếng Anh 116) CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƢƠNG 1.1.1 Diễn biến lâm sàng vết thƣơng, vết bỏng sâu Thông thƣờng, vết thƣơng liền vòng – tuần Các vết thƣơng khuyết da bỏng sâu toàn lớp da trình liền vết thƣơng phải trải qua q trình hình thành mơ hạt Tùy thuộc vào diện tích, độ sâu vết bỏng, sức đề kháng thể, vết bỏng tiến triển theo ba giai đoạn đan xen là: Giai đoạn cấp tính, giai đoạn tái tạo giai đoạn hình thành sẹo 1.1.2 Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng Quá trình liền vết thƣơng có nhiều chế phức tạp nhƣng kết cuối tái lập lại mô tế bào bị tổn thƣơng Do quan niệm điều trị tổn thƣơng quan thể tế bào tổn thƣơng phải đƣợc thay tế bào khoẻ mạnh Để trì chức bảo vệ thể, ngƣời cần có da Thành phần tế bào da ngƣời chủ yếu gồm loại nguyên bào sợi tế bào sừng 1.1.2.1 Nguyên bào sợi 1.1.2.2 Tế bào sừng 1.2 GHÉP TẾ BÀO ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG Do có vai trị quan trọng định trực tiếp tới trinh liền vết thƣơng nên nguyên bào sợi tế bào sừng tế bào đƣợc nuôi cấy để ghép điều trị vết thƣơng 1.2.1 Vật liệu tƣơng đƣơng trung bì có tế bào Vật liệu thay trung bì có tế bào vật liệu dùng nguyên bào sợi để tạo cấu trúc tái sinh giá đỡ làm từ số nguyên liệu khác 4 Cấu trúc đƣợc cấy nguyên bào sợi để tổng hợp protein thành phần khác đệm gian bào mà có tác dụng kích thích tế bào vết thƣơng ngƣời bệnh tăng cƣờng hoạt động để làm nhanh liền vết thƣơng * TransCyte * Dermagraft 1.2.2 Vật liệu tƣơng đƣơng biểu bì có tế bào * Epicel * Laserskin 1.2.3 Vật liệu tƣơng đƣơng da hai lớp có tế bào Vật liệu tƣơng đƣơng da hai lớp gồm biểu bì trung bì sản phẩm phức tạp cấu trúc Vật liệu đƣợc tạo nuôi cấy nguyên bào sợi tế bào sừng giá thể collagen chất lycosaminoglycan… Vật liệu tƣơng đƣơng da đồng loại sản phẩm tiến gần đây, chúng đƣợc lƣu hành thị trƣờng Hai sản phẩm nguyên mẫu dạng Apligraf Orcel 1.3 TẾ BÀO GỐC, TIỀM NĂNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC 1.3.1 Tế bào gốc, đặc tính phân loại tế bào gốc Tế bào gốc tế bào chƣa có chức chuyên biệt, chúng có tiềm phát triển thành nhiều loại tế bào khác có khả tự thay Dựa theo nguồn gốc thời điểm phân lập, phân loại tế bào gốc thành nhóm sau: - Tế bào gốc phôi - Tế bào gốc thai - Tế bào gốc nhũ nhi - Tế bào gốc trƣởng thành - Tế bào vạn tiềm cảm ứng 1.3.2 Ứng dụng tế bào gốc điều trị bệnh 1.3.3 Các tiềm ứng dụng tế bào gốc 1.3.4 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào da dùng điều trị vết thƣơng 1.3.4.1 Biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành ngun bào sợi 1.3.4.2 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào sừng 1.4 DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO GỐC PHÂN LẬP TỪ MÀNG DÂY RỐN Năm 2004, nhóm nghiên cứu Đại học Quốc gia Singapore thành công việc xác định phân lập đƣợc TBG biểu mô TBG trung mô từ màng dây rốn Cả hai loại tế bào gốc biểu mơ trung mơ màng dây rốn có loại marker là: Oct (Octamer 4) Nanog (Pluripotency Sustaining ES Cell Factor) Điều gợi ý cho thấy tính gốc hai loại tế bào cao so với tính gốc tế bào tuỷ xƣơng, máu cuống rốn hay tế bào gốc trƣởng thành khác CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lô: Lô 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch tế bào gốc trung mô màng dây rốn ngƣời ghép dị loại Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh giá hiệu ghép tế bào gốc trung mô điều trị vết bỏng nhiệt thực nghiệm Thỏ thí nghiệm trƣởng thành từ 10-12 tháng tuổi, Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phịng cung cấp Ni đảm bảo tiêu chuẩn thực nghiệm 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Mẫu mô dây rốn Mô dây rốn thu từ sản phụ sau sinh với tiêu chuẩn nguồn mô nhƣ sau: - Tiêu chuẩn y đức nguồn cung cấp mô: - Tiêu chuẩn sàng lọc - Ngƣời hiến dây rốn thử máu âm tính với bệnh truyền nhiễm - Tính pháp lý nguồn mơ nghiên cứu 2.2.2 Hóa chất chủ yếu dùng nghiên cứu Các hố chất vật tƣ ni cấy hãng Invitrogen PAAcung cấp, đạt tiêu chuẩn quốc tế an tồn độc tính, vi khuẩn, mycoplasma vi rút Môi trƣờng nuôi cấy tế bào trung mô Ngân hàng tế bào gốc Mekostem (Việt Nam) cung cấp theo quyền chuyển nhƣợng công ty CRC (Singapore) 2.2.3 Các vật tƣ tiêu hao chủ yếu Màng Tegaderm, Các vật tƣ tiêu hao hãng Corning, 3M, Baxter cung cấp đạt tiêu chuẩn quốc tế vô trùng phục vụ mục đích ni cấy tế bào 2.2.4 Các thiết bị dụng cụ chủ yếu - Phịng ni cấy tế bào - Kính hiển vi đảo ngƣợc - Máy ly tâm lạnh - Tủ hood lọc khơng khí vơ trùng - Tủ ấm (incubator) - Pipet Aid - Tủ lạnh gia dụng - Tủ lạnh âm 860C âm 1520C - Tank Nitơ lỏng - Thiết bị hạ nhiệt độ theo chƣơng trình hộp hạ nhiệt độ với cồn PIA - Nỉa, kéo 2.2.5 Các giá đỡ để tạo vật liệu tƣơng đƣơng trung bì Màng Tegaderm chất liệu polyurethane hãng 3M Health Care, USA cung cấp đƣợc dùng để làm giá đỡ tế bào 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Các phƣơng pháp nghiên cứu phân lập, nuôi cấy biệt hóa tế bào 2.3.1.1 Phân lập tế bào gốc trung mô 2.3.1.2 Cấy chuyển nhân rộng số lƣợng tế bào gốc trung mô dây rốn 2.3.1.3 Đánh giá khả tạo colony tế bào 2.3.1.4 Xác định số lƣợng tế bào nuôi cấy Số lƣợng TB đƣợc tính theo cơng thức: C = n/v (n: số lƣợng TB đếm đƣợc buồng đếm, v: thể tích đếm (ml), C: mật độ TB (TB/ml) Trong buồng đếm Neubaeur tích 0,1mm3 = 1.10-4 ml cơng thức tính là: C = n x 104/ml 2.3.1.5 Đánh giá hình thái tế bào - Đánh giá hình thái tế bào phƣơng pháp nhuộm giemsa - Đánh giá hình thái mơ phƣơng pháp nhuộm HE - Đánh giá hình thái siêu cấu trúc 2.3.1.6 Phƣơng pháp khảo sát biểu kháng nguyên HLA tế bào gốc trung mơ - Phân tích biểu HLA-G HLA-E kỹ thuật western blot - Phân tích HLA-DR kỹ thuật flowcytometry 2.3.1.7 Xác định tính sinh miễn dịch tế bào gốc Nguyên liệu chuẩn bị - Tế bào gốc: dòng tế bào nguồn gốc hệ tế bào sử dụng ghép cho thỏ trình nghiên cứu thực nghiệm - Huyết thỏ: mẫu máu thỏ đƣợc lấy thời điểm: Bắt đầu nghiên cứu ghép tế bào gốc - D0 thời điểm sau D15, D30, D60 Phương pháp phân tích miễn dịch ELISA 2.3.1.8 Biệt hóa tế bào gốc mô thành tế bào dạng nguyên bào sợi - Môi trƣờng cảm ứng biệt hóa - Các bƣớc biệt hóa - Xác định khả tạo vật liệu tƣơng đƣơng trung bì tế bào 2.3.1.9 Xét nghiệm ELISA collagen typ I dịch tế bào biệt hóa 2.3.2 Các phƣơng pháp đánh giá hiệu ghép tế bào điều trị vết thƣơng thực nghiệm 2.3.2.1 Quy trình nghiên cứu thực nghiệm Thỏ nghiên cứu (n = 30) Gây bỏng thực nghiệm bên lƣng thỏ Cắt lọc hoại tử vết thƣơng bỏng Vùng B (n = 30) Đắp vật liệu Tegaderm khơng có tế bào Vùng A (n = 30) Đắp vật liệu tƣơng đƣơng trung bì Theo dõi diễn biến vết thƣơng bỏng vào thời điểm D0, D5, D10 Theo dõi diễn biến vết thƣơng bỏng vào thời điểm D0, D5, D10 Kết luận Sơ đồ 2.1 Thiết kế nghiên cứu vết thƣơng bỏng thực nghiệm 2.3.2.2 Gây bỏng thực nghiệm - Phương pháp gây bỏng: Theo phƣơng pháp Halovec Pocicado 1961 (có cải tiến) 2.3.2.3.Thay băng chăm sóc vết thƣơng 2.3.2.4 Ghép tế bào lên vết thƣơng Vùng A – vùng nghiên cứu ghép tế bào (quy định vết thƣơng bên phải lƣng thỏ), vùng B – vùng đối chứng (chỉ ghép màng Tegaderm đơn thuần) 2.3.2.5 Xét nghiệm hình thái cấu trúc mơ vết thƣơng 2.3.2.6 Xét nghiệm vi khuẩn vết bỏng - Xác định số lƣợng vi khuẩn có cm2 vết bỏng theo công thức: SLVK/ cm2 = (5 N1 x 103) + (5 N2 x 102) N1: Số lƣợng khuẩn lạc đĩa thạch cấy lúp 0,001 N2: Số lƣợng khuẩn lạc đĩa thạch cấy lúp 0,01 5: ml nƣớc muối 0,9% 2.3.2.7 Các tiêu theo dõi toàn thân * Toàn thân * Cân nặng thỏ 2.3.2.8 Các tiêu theo dõi chỗ vết thƣơng - Theo dõi hàng ngày diễn biến - Tính diện tích vết thƣơng 2.3.2.9 Các xét nghiệm huyết học sinh hoá máu - Xét nghiệm huyết học - Xét nghiệm sinh hoá 2.3.2.10 Xác định hoạt độ enzym GOT huyết 10 2.3.2.11 Xác định hoạt độ enzym GPT huyết 2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu đựơc tính theo trị giá trung bình (X  SD ) tỷ lệ % Xử lý số liệu phần mềm SPSS 16.0 khác biệt có ý nghĩa thống kê P0,05 Dịch nuôi cấy (n=5) 0,069 ± 0,003 0,297 ± 0,011 0,05