ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC NGUYỄN VĂN ĐỨC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG VI KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT PROBIOTIC TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI- 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC NGUYỄN VĂN ĐỨC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG VI KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT PROBIOTIC TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh TS. Nguyễn Thị Hồng Loan Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Nguyễn ThịVân Anh và TS. Nguyễn Thị Hồng Loan đã giúp đỡ và hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Từ tận đáy lòng, tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh, người đã luôn động viên, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, người đã chỉ dạy tôi những kiến thức khoa học cũng như cách làm việc một cách khoa học đồng thời đã tạo điều kiện để tôi tiếp tục được nghiên cứu khoa học. Tôi cũng chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ, và các bạn bè trong phòng Sinh học Nano và Ứng dụng cũng như phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình làm luận văn cao học. Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phòng công tác chính trị học sinh và sinh viên, Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ này! Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới công ty ANABIO R&D đã giúp đỡ tôi trong quá trình sản xuất bào tử của một số chủng Bacillus phân lập trong khóa luận, cảm ơn KS. Nguyễn Thị Loan, Trung tâm chẩn đoán Thú y – Tập đoàn DABACO đã giúp đỡ tôi trong việc thử nghiệm các chế phẩm probiotic trên gà siêu thịt. Cho phép tôi giửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, đồng nghiệp ở bộ môn Tự nhiên, trường THPT Vân Nội, Đông Anh, Hà Nội đã tạo điều kiện về mặt thời gian và chuyên môn cũng như động viên để tôi yên tâm đi học cao học. Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Văn Đức DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ/cụm từ viết đầy đủ Bp Base pair (cặp nuclêôtit) CFU Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) DNA Deoxyribonucleic Acid DSM Difco Sporulation Medium EtBr Ethidium bromide FAO/WHO Food and Agriculture Orgaization of the United Nations/ World Health Organization FCR Feed conversion ratio (hệ số chuyển đổi thức ăn) G+C Guanine+Cytosine LB Luria Bertani NA Nutrient Agar PCR Polymerase chain reaction rDNA Rebosomal Deoxyribonucleic Acid RFLP Restriction fragment length polymorphism RO Reverse osmosis S Svedberg ( đơn vị lắng) TLR Toll-like receptors TSA Tryptone Soya Broth Agar TSB Tryptone Soya Broth VP Voges-Proskauer DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 1. pH và thời gian tồn tại của thức ăn ở các phần khác nhau trong ống tiêu hóa của gà 4 Bảng 2. Các chi của vi khuẩn đã phát hiện trong hồi tràng và manh tràng bằng kỹ thuật giải trình tự 16S rDNA 6 Bảng 3. Một số mô tả và khái niệm về probiotic được chính dẫn nhiều trong các năm qua 11 Bảng 4. Bảng 4. Các tiêu chí lựa chọn probiotic ứng dụng trong thương mại 13 Bảng 5. Một số vi sinh vật được dùng làm probiotic 20 Bảng 6. Một số sản phẩm probiotic dùng cho gia cầm có mặt trên thị trường 22 Bảng 7. Một số sản phẩm thương mại chứu bào tử Bacillus 27 Bảng 8. Tính chất sinh lí hóa sinh của một số chủng Bacillus phân lập từ ruột gà 45 Bảng 9. Kết quả định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử 49 Bảng 10. Các phân đoạn thu được khi cắt gen 16S ribosome của các chủng vi khuẩn bằng bộ enzyme Alf II và Alw 26I theo lý thuyết 52 Bảng 11. Kết qủa thử hoạt tính kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn 55 Bảng 12 Thử nghiệm trên diện rộng thức ăn bổ sung bào tử B. subtilis CH16 trên gà siêu thịt 63 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Cấu tạo hệ tiêu hóa ở gà 3 Hình 2. Thành phần của hệ vi khuẩn trong hồi tràng và manh tràng của gà giò được xác định bằng giải trình tự 1230 dòng từ cộng đồng 16S rDNA trong thư viện DNA 7 Hình 3. Chu trình hình thành, nảy mầm của nội bào tử thuộc chi Bacillus và cấu trúc của nội bào tử 9 Hình 4. Hướng dẫn cho đánh giá Probiotic sử dụng cho thực phẩm 15 Hình 5. Sự ức chế của các vi khuẩn thối giữa và tăng cường chức năng của rào chắn và mô hình đáp ứng miễm dịch niêm mạc của vi khuẩn probiotic 19 Hình 6. Một số chủng không sắc tố đã phân lập 43 Hình 7. Một số tính chất sinh lí hóa sinh của các chủng CH phân lập từ ruột gà 46 Hình 8. Kết quả điện di genome và điện di sản phẩm nhân bản gen mã hóa 16S rRNA bằng kĩ thuật PCR 48 Hình 9. Cây phân loại các chủng Bacillus 50 Hình 10 Sơ đồ các phân đoạn thu được sau khi xử lí bởi bộ enzyme giới hạn Alw26I và AflII của gen mã hóa 16S ribosome của các chủng vi khuẩn 51 Hình 11. Phân biệt các chủng vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR-RFLP 53 Hình 12. Hiệu suất tạo bảo tử của các chủng vi khuẩn 56 Hình 13. Độ bền của bào tử của chủng CH16 và CH22 từ pH từ 2 đến 10 58 Hình 14. Độ bền của bào tử ở các nồng độ muối khác nhau 59 Hình 15. Biofilm tạo thành trên đĩa thạch CMK của các chủng HU58 và CH16, và khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch của các chủng PY79 và CH22 ở điều kiện 60 Hình 16 Ảnh chụp chế phẩm chứa bào tử dạng bột (A), ảnh bào tử dưới kính hiển vi điện tử (B) và ảnh khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (C) của 2 chủng CH16 và CH22 61 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1.1. Hệ tiêu hóa của gà 2 1.1.1. Cấu tạo hệ tiêu hóa và sinh lí tiêu hóa ở gà 2 1.1.2. Hệ vi khuẩn đường ruột của gà 4 1.1.3. Các vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột gà 7 1.2. Probiotic 9 1.2.1. Khái niệm chung về probiotic 9 1.2.2. Probiotic sử dụng cho gia cầm 21 1.2.3. Các chủng vi khuẩn Bacillus sử dụng làm probiotic cho gia cầm 27 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 29 2.1.1. Mẫu ruột gà 29 2.1.2. Các chủng vi khuẩn tham chiếu 29 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 29 2.1.4. Hóa chất sinh học phân tử 32 2.1.5. Các hóa chất khác 33 2.1.6. Dụng cụ và thiết bị 33 2.2. Phương pháp nghiêu cứu 33 2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột gà 33 2.2.2. Các kỹ thuật vi sinh và hóa sinh cơ bản 34 2.2.3. Phân tích trình tự 16S rRNA 38 2.2.4. Kỹ thuật PCR-RFLP 39 2.2.5. Điều kiện sinh trưởng tối ưu 40 2.2.6. Sản xuất bào tử trong nồi lên men 40 2.2.7. Thử nghiệm chế phẩm probiotic trên gà siêu thịt ở diện rộng 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. Các chủng vi khuẩn Bacillus không sắc tố được phân lập từ ruột gà 43 3.2. Tính chất sinh lý, sinh hóa của một số chủng Bacillus có hoạt tính ưu việt 44 3.3. Định danh loài bằng phân tích 16S rRNA 47 3.4. Phân biệt các chủng đã phân lập bằng kỹ thuật PCR-RFLP 50 3.5. Một số tính chất probiotic của các chủng Bacillus được tuyển chọn 53 3.5.1. Tính kháng kháng sinh 53 3.5.2. Hiệu suất tạo bào tử 55 3.5.3. Độ bền của bào tử trong các môi trường pH khác nhau 56 3.5.4. Độ bền của bào tử trong dung dịch muối 57 3.5.5. Khả năng tạo biofilm 58 3.6. Điều kiện sinh trưởng tối ưu và thu chế phẩm probiotic dạng bào tử sau lên men 59 3.7. Tăng trọng trên gà siêu thịt và giảm chỉ số tiêu thụ thức ăn 60 KẾT LUẬN 63 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 1 MỞ ĐẦU Theo định nghĩa của WHO/FAO, Probiotic hay còn gọi là lợi khuẩn là những vi sinh vật sống, khi được sử dụng với lượng thích hợp sẽ mang lại các tác dụng có lợi cho vật chủ. Probiotic dạng bào tử của một số vi khuẩn thuộc chi Bacillusnhư B. subtilis và B. licheniformis được sử dụng ngày càng rộng rãi trong chăn nuôi và thủy sản vì bào tử có tính chất bền nhiệt giúp sản phẩm ổn định chất lượng trong quá trình chế biến với thức ăn và bảo quản. Với gia cầm, đặc biệt là đối vớigà siêu thịt, đã có nhiều sản phẩm probiotic nổi tiếng được sản xuất cả ở Châu Âu và ở Mỹ. Đặc điểm chung của các sản phẩm này là các chủng vi khuẩn được nghiên cứu sâu về tính chất và độ an toàn, cũng như các hoạt tính có lợi cho sức khỏe của vật chủ. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn thường không có nguồn gốc từ hệ tiêu hóa mà thường được phân lập từ đất, duy nhất chỉ có 01 sản phẩm Clostat của hãng Kemin, Mỹ, gồm chủng B. subtilis PB6 là có nguồn gốc từ hệ tiêu hóa. Ngoài ra, một số chế phẩmcũng chưa được sản xuất ở dạng bào tử hoàn toàn mà còn lẫn một tỷ lệ tế bào sinh dưỡng nên bị giảm sút độ sống khi xử lý nhiệt trong quá trình chế biến thức ăn cho gia cầm. Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng probiotic trong nuôi gà siêu thịtngày càng tăng với mục đích chủ yếu kích thích tăng trọng và tăng cường sức khỏe, phòng bệnh cho gà. Các chủng vi khuẩn sử dụng làm probiotic cho gà cũng đã được nhiều tác giả tại các trường đại học và viện nghiên cứu trong nước phân lập, xác định tính chất và thử nghiệm tác dụng trên gà. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào đề cập tới việc phân lập các chủng Bacillus từ chính ruột gà để tạo chế phẩm probiotic sử dụng cho gà. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập và xác định tính chất các chủng vi khuẩn Bacillus từ ruột gà để sản xuất probiotic tăng trọng cho gà siêu thịt” nhằm sàng lọc các chủng vi khuẩnBacillus có hoạt tính probiotic ưu việt và thân thiện với hệ tiêu hóa của gà, nhờ đó phát huy hiệu quả tác dụng tăng trọng cho gà siêu thịt. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Hệ tiêu hóa của gà 1.1.1. Cấu tạo hệ tiêu hóa và sinh lí tiêu hóa ở gà Hệ tiêu hóa ở gà có cấu tạo khá đặc biệt để thích nghi với thức ăn là thực vật và khoang miệng hẹp, không có răng. Thức ăn được đưa vào diều, diều là một cái túi phình to của thực quản, là nơi chứa thức ăn và nhào trộn với dịch tiết để làm cho thức ăn mềm ra. Một trong cấu tạo đặc biệt khác trong hệ tiêu hóa ở gà đó là dạ dày cơ, dạ dày cơ có thành cơ chắc khỏe, là nơi nghiền nát thức ăn trước khi được đưa tới tá tràng. Một dặc điểm khác biệt so với dạ dày của động vật nói chung đó là dạ dày cơ không có khả năng tiết bất cứ loại enzyme nào, một số enzyme đươc dạ dày tuyến tiết ra để hòa trộn vào trong thức ăn giúp tăng hiệu quả tiêu hóa ở dạ dày cơ. Đặc biệt, để tăng hiệu quả tiêu hóa cơ học, gà còn ăn thêm những hạt sỏi nhỏ, đó là cách tăng ma sát cơ học giúp thức ăn thực vật bị nghiền nhỏ thành những mảnh vụn li ti để quá trình tiêu hóa ở ruột diễn ra hiệu quả. So với tất cả các động vật ăn thực vật, gà là nhóm động vật có cách tiêu hóa khá đặc biệt, thời gian tồn tại của thức ăn tại diều và dạ dày của gà là khá lâu so với các phần còn lại trong ống tiêu hóa [67], điều này được thể hiện rất rõ qua Bảng 1. Lối tiêu hóa diễn ra từ từ ở phần đầu của ống tiêu hóa với pH thấp đã ức chế sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật. Đó cũng là một vấn đề khó khăn khi đưa các loại probiotic là các tế bào sinh dưỡng vào trong ống tiêu hóa của gà vì có thể số tế bào probiotic vượt qua được dạ dày với nồng độ không đủ lớn để phát huy tác dụng. Quan sátHình 1 cho thấy, lượng axít hữu cơ tiết ra trong ống tiêu hóa với nồng độ cao làm cho pH ở các phần đầu ống tiêu hóa thấp, điều này khẳng định rằng các axít hữu cơ có vai trò trực tiếp quyết định đến hệ vi khuẩn đường ruột, làm giảm các vi nhuẩn gây bệnh và kiểm soát các quần thể chủ yếu cạnh tranh chất dinh dưỡng đối với gà [28]. Đây cũng chính là cơ sơ để các nhà nghiên cứu đánh giá về tác động [...]... giản của các dữ liệu in vivo và in vitro a d 19 Cho đến nay, probiotic có nguồn gốc rất đa dạng Có thể probiotic được phân lập từ đất, từ thực vật, động vật và con người Thông thường, probiotic có tính an toàn cao và thân thiện với vật chủ là probiotic được phân lập từ chính cơ thể của vật chủ và đa số là từ hệ tiêu hóa Các probiotic phổ biến là từ các chi như Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, ... 16], các nhóm vi sinh vật , vật làm cho FCR thấp bao gồm Lachnospiraceae, Lactobacillus và Clostridiales Hệ p g H vi sinh vật đường ruột cũng đóng góp quan trong trong vi chống lại các tác nhân ũng vi c ng l gây bệnh đường ruột, đặ biệt là một số vi khuẩn hội sinh có khả năng tiết ra chất ặc ti kháng vi khuẩn, hạn chế sự phát triển của các mầm bệnh [6] 1.1.3 Các vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột gà. .. làm tăng tuổi thọ cho người nông dân Bulgari Ông cũng cho rằng sự phụ thuộc của các vi khuẩn đường ruột vào thức ăn làm cho chúng có khả năng biến đổi hệ vi khuẩn đường ruột và thay thế các vi khuẩn có hại bằng các vi khuẩn có lợi [22] Do vậy, 9 ông đã phát triển một chế độ ăn với sữa được lên men bằng vi khuẩn mà ông đặt tên cho nó là “Bulgarian bacillus Vào những năm 1930 thì Minoru Shirota đã phân. .. nhầm và đánh đồng với tác động có lợi do các vi sinh vật hội sinh đem lại, sự lạm dụng này đã gây ra hiểu nhầm rằng các yếu tố dinh dưỡng hoặc các yếu tố môi trường có thể kích hoạt các probiotic bẩm sinh trong cơ thể Các vi khuẩn hội sinh trong cơ thể thường là nguồn quan trọng để phân lập và tuyển chọn ra các probiotic Tuy nhiên, ngay cả khi các chủng ưu vi t đó được xác định đầy đủ các tính chất. .. ứng miễm dịch niêm mạc của vi khuẩn probiotic [52] n probi A.Sự ức chế các vi khu thối giữa, (1) sự sản xuất các chất kháng vi khuẩn/ khuẩn t khu chất bảo vệ, (2) ức chế cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh, (3) sự ức chế c ch nh, s tính bám hoặc khả năng di chuyển của các vi khuẩn gây bệnh, (4) giảm pH nh, gi đường ruột và (5) tăng cường khả năng rào chắn của thành ruột nhờ tăng sự t cư a ru phát triển... 1.1.2 Hệ vi khuẩn đường ruột của gà Vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe thông qua các tác động của nó tới hình thái ruột, dinh dưỡng, sinh bệnh học của các bệnh đường ruột và các đáp ứng miễn dịch [34] Hệ vi khuẩn đường ruột cũng được cho là có khả năng chống xâm lấn của các mầm bệnh trong đường ruột và kích hoạt các đáp ứng miễn dịch [45] Các nghiên cứu về hệ vi khuẩn trong... giữa các vi khuẩn với vật chủ tạo nên một sự cân bằng động [64] Có một số cơ chế hoạt động của các prbiotic trong cơ thể vật chủ như: 1) Duy trì hệ vi sinh vật đường ruột bằng cách loại trừ vi sinh vật cạnh tranh và các vi sinh vật đối kháng [3, 33, 36, 47, 54]; 2) Thúc đẩy trao đổi chất bằng cách tăng hoạt tính của các enzyme tiêu hóa và giảm hoạt tính enzyme của các vi khuẩn cũng như giảm sản xuất. .. gà ngày càng được chú ý Các vi khuẩn dễ nuôi cấy chiếm ưu thế trong manh tràng, đa số là các vi khuẩn kỵ khí bắt bắt buộc, với mật độ 1011/g trọng lượng [10] Ít nhất có 38 loại vi khuẩn kỵ khí khác nhau đã được phân lập từ manh tràng của gà và chúng bao gồm nhiều chủng khác nhau [9] Mead (1989) đã tìm thấy các cầu khuẩn gram dương như Peptostreptococcus chiếm 28% tổng số vi khuẩn có thể nuôi cấy, các. .. phục lại từ thư vi n manh tràng biểu hiện trình tự tương đồng thấp với các gen của các chi vi khuẩn đã biết Trong nghiên cứu của mình,Jiangrang và cộng sự (2003) đã dùng phương pháp phân tích trình tự của 16S rDNA của cộng đồng vi khuẩn phân lập trong ống tiêu hóa của gà Kết quả cho thấy cộng đồng vi khuẩn trong ruột gà được chia thành 4 nhóm: Nhómvi khuẩn gram dương có G+C thấp, nhóm vi khuẩn gram... khỏe cho cơ thể vật chủ” Bảng 3 dưới đây mô tả lại các khái niệm về probiotic qua các năm cho tới khi có được một định nghĩa chính thức về probiotic Bảng 3.Một số mô tả và khái niệm về probiotic được trích dẫn nhiều trong các năm qua [8] Mô tả Nguồn Probiotics có phổ biến trong thực phẩm rau quả như các Kollath (1953) vitamin, các hợp chất thơm, các emzyme, và các chất có ích khác để kết nối các quá . VĂN ĐỨC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG VI KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT PROBIOTIC TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật. KHOA SINH HỌC NGUYỄN VĂN ĐỨC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG VI KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT PROBIOTIC TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC. tới vi c phân lập các chủng Bacillus từ chính ruột gà để tạo chế phẩm probiotic sử dụng cho gà. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập và xác định tính chất các chủng vi khuẩn Bacillus