iv MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA i LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vii MỞ ĐẦU viii CHƯƠNG I TỒNG QUAN 1 I . Lịch sử phát triển Cảm biến sinh học (biosensor) 1 II. Cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc của sợi nano (nanowire based biosensors) 3 CHƯƠNG II: QUI TRÌNH DEA VÀ CÁC KĨ THUẬT DÙNG ĐỂ CHẾ TẠO SỢI NANO SILICON 7 I. Qui trình Deposition and Etching under Angle (DEA) để chế tạo sợi nano silicon 7 II. Các kĩ thuật cơ bản sử dụng trong qui trình DEA 12 II.1 Công nghệ quang khắc 12 II.2 Công nghệ ăn mòn thẳng đứng 17 II.3 Kỹ thuật tạo màng mỏng kim loại dị hướng 18 III.4 Kỹ thuật ăn mòn dị hướng màng kim loại 22 CHƯƠNG III CHẾ TẠO SỢI NANO SILICON BẰNG PHƯƠNG PHÁP DEA VÀ KẾT QỦA CHẾ TẠO 24 I. Chế tạo sợi bằng Qui trình DEA 24 II. Kết quả chế tạo 27 II.1 Kích thước và tính chất bề mặt 27 II.2 Tính chất điện 28 CHƯƠNG IV KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN DNA CỦA CẢM BIẾN 30 I. Biến đổi bề mặt sợi Si-NWs 30 I.1 Tạo sự đồng nhất trên bề mặt sợi có lớp SiO 2 30 I.2 Tạo sự đồng nhất trên bề mặt sợi Si không có SiO 2 35 II Định lượng DNA bằng cảm biến sinh học Si- NWs 40 v II1 Ly trích DNA của bắp chuyển gene 40 II2 Phát hiện bắp chuyển gen bằng cảm biến Si-NWs 42 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFM Automic Force Microscope, kính hiển vi lực nguyên tử APTES AminoPropylTriEthoxySilane BOX Buried oxide lớp oxít bên trong DEA Deposition and Etching under Angles, lắng đọng và ăn mòn theo góc nghiên DNA Deoxyribo Nucleic Acid FET Field Effect Transistor, Tranzitor hiệu ứng trường HDP High Density Plasma Plasma mật độ cao, áp suất thấp IBE Ion Beam Etching ăn mòn bằng chùm ion LPVCD Low Pressure Chemical Vapour Deposition, phương pháp lắng đọng hơi hóa học áp suất thấp PNA Peptide Nucleic Acid PTN CNNN Phòng Thí Nghiện Công Nghệ NaNo PECVD Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition lắng đọng hoá học pha hơi kèm hỗ trợ plasma RNA RiboNucleic Acid RIE Reactive Ion Etching, phản ứng ăn mòn ion Si – NW Silicon Nano Wire, sợi nano silic SOI Silicon On Insulator, slic trên đế điện môi TFA TriFluoroacetic Acid UV Utra Violet, tia cực tím vii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1: Mô hình cảm biến sinh học đầu tiên 1 Hình 2: Nguyên lí hoạt động và cấu trúc của bộ kít nano sinh học dựa trên sợi nano 4 Hình 3: Sử dụng bộ kít sợi nano để phát hiện nhanh 6 Hình 4: Sơ đồ khối các bước công nghệ cơ bản của qui trình DEA 10 Hình 5: Mô hình mặt nạ 13 Hình 6: Quy trình quang khắc 13 Hình 7: Cách phủ lớp photoresist 15 Hình 8: Các phương pháp chiếu 16 Hình 9: Cấu tạo hệ ăn mòn ion phản ứng 18 Hình 10: Cấu tạo hệ bốc bay chân không cơ bản 19 Hình 11: Màng bay hơi trên bậc thang 19 Hình 12: Nguồn bay hơi bằng chùm tia điện tử 21 Hình 13: Sơ đồ hệ ăn mòn phún xạ. 23 Hình 14: Hình ảnh SEM và AFM của sợi nano silicon chế tạo ra 27 Hình 15 : Đặc trưng I-V của sợi nano silicon dài 10 micron 28 Hình 16 : Các chất sử dụng để silane hóa. 31 Hình 17: Cơ chế phản ứng của quá trình silan hoá 31 Hình 18: Ảnh SEM của bề mặt wafer silic sau khi xử lý bằng dung dịch APTES. 32 Hình 19: Sợi silicon trước khi gắn glutaraldehyte 32 Hình 20: Ảnh SEM của bề mặt wafer sau khi xử lý bằng dung dịch glutaraldehyde. 33 Hình 21: Sau khi gắn thụ thể là PNA 33 Hình 22: Cơ chế khử lớp SiO 2 trên mặt sợi Si-NWs. 35 Hình 23: Sợi silic sau khi gắn 10-N-BOC. 36 viii Hình 24: Loại bỏ các nhóm chức bảo vệ gốc amin 36 Hình 25: Lớp bề mặt của sợi sau khi xử lý qua TFA và NH 4 OH 36 Hình 26: Lớp bề mặt của sợi sau khi gắn thụ thể là PNA 37 Hình 27: Sản phẩm ly trích DNA của bắp chuyển gene. 41 Hình 28: Hệ thiết bị để tiến hành ghi lại sự thay đổi của dòng điện chạy qua sợi . 42 Hình 29 : Đặc trưng I-t của chíp sạch (chip chưa biến đổi bề mặt sợi) cho thấy dòng điện qua sợi không thay đổi khi cho dung dịch chứa DNA đi qua 43 Hình 29: Đặc trưng I-t của chíp chip chưa biến đổi bề mặt sợi và chíp đã biến đổi bề mặt khi cho dung dịch chứa 1 nM DNA 43 PHẦN MỞ ĐẦU Phát hiện và định lượng nhanh các phần tử sinh học như glucose, protein, ADN… ở nồng độ siêu nhỏ là một yêu cầu vô cùng quan trọng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng của các ngành sinh học, y tế, dược phẩm và nông nghiệp… Ví dụ thông qua việc phát hiện các protein đặc trưng (protein markers), ADN đột biến (gen mutation), kháng nguyên và kháng thể (antibodies, antigents), glucose… trong bệnh phẩm, cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác nhiều bệnh nguy hiểm như ung thư, lây nhiễm virus, sản phẩm đột biến gen, tiểu đường… Những thành tựu đột phá trong lĩnh vực sinh học phân tử và y sinh gần đây đã xác định được trên 140 chất đánh dấu sinh học (biological markers) như vậy, mở ra những khả năng hoàn toàn mới cho nghiên cứu và ứng dụng trong các ngành khoa học liên quan như sinh học, y học, dược phẩm, nông nghiệp… Có nhiều kĩ thuật và phương pháp đã và đang được sử dụng để phân tích và định lượng các phần tử sinh học trên như kĩ thuật ELISA, Polymer Chain Reaction (PCR), Surface Plosmon Resonance (SPR), cộng hưởng từ, phân tích hóa học… Tuy thế, chưa có phương pháp nào trong các phương pháp truyền thống này có đầy đủ khả năng cho phép phát hiện nhanh, chính xác, đồng thời các phân tử sinh học nói trên. Do đó việc nghiên cứu, chế tạo ra một thế hệ cảm biến mới có khả năng như thế đang được đặc biệt quan tâm và đầu tư nghiên cứu. Và một khả năng đặc biệt quan trọng đối với các thiết bị phân tích hiện nay cần được nghiên cứu, nâng cao đó là độ nhạy. Ví dụ việc phát hiện nhanh các chất đánh dấu sinh học nói trên ở nồng độ siêu nhỏ (trong khoảng nM-fM), sẽ cho phép chẩn đoán được bệnh trong thời gian tiền nhiễm bệnh. Trong thời gian này, các phương pháp y học (cả truyền thống và hiện đại) đều phát huy rất hiệu quả trong việc chữa trị, thậm chí với những bệnh hiểm nghèo như ung thư. Gần đây, nghiên cứu của các nhà y học Anh cho thấy, nếu bệnh ung thư tuyến tiền liệt được phát hiện trong giai đoạn sơ khởi (tiền nhiễm bệnh), thì bệnh nhân không cần dùng đến các phương pháp can thiệp của y học hiện đại (tốn kém, nhiều ảnh hưởng phụ). Trong trường hợp này, bệnh nhân chỉ cần uống nhiều nước, ăn nhiều rau quả, tránh căng thẳng (tress), thì bệnh gần như không phát triển hoặc thậm chí khỏi hẳn. Cảm biến sinh học trên cơ sở sợi nano silicon (Silicon nanowire biosensors): Sợi nano được định nghĩa là vật liệu ở dạng sợi với đường kính sợi trong khoảng 1-100 nm. Như thế, chúng ta phải bó ít nhất 1 triệu sợi nano lại với nhau để có một vật thể có kích thước ngang bằng sợi tóc người với đường kính trung bình là 100 micron. Khi ở dạng siêu nhỏ sợi nano, phần lớn các lớp nguyên tử cấu tạo nên sợi sẽ nằm trên bề mặt, dẫn đến các tính chất của sợi, đặc biệt là điện trở của sợi, rất nhạy với các thay đổi của môi trường bên ngoài. Tính chất này làm sợi nano trở thành vật liệu lí tưởng để chế tạo các cảm biến sinh học thế hệ mới - cảm biến sinh học sợi nano - với khả năng hoàn toàn mới mà linh kiện truyền thống không có được. Do đó, việc nghiên cứu qui trình công nghệ, chế tạo ra các cảm biến sợi Si-NWs và ứng dụng cảm biến loại này vào phân tích sinh học đã và đang được quan tâm đặc biệt, và được tiến hành ở các nhóm nghiên cứu thuộc các Đại học hàng đầu trên thế giới và trong nước. Mục tiêu của luận văn Thạc sĩ này là: “Nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc nano silicon”. Đề tài được thực hiện, sử dụng các thiết bị chế tạo và đo đạc tại Phòng thí Nghiệm Công Nghệ Nano, ĐHQG Tp.HCM. Nội dung nghiên cứu được trình bày trong các phần chính sau: Chương 1 – Tổng quan - Giới thiệu sơ lược về cảm biến sinh học. - Giới thiệu về cảm biến sinh học Chương 2 – Qui trình DEA và các kĩ thuật dùng để chế tạo sợi nano silicon - Qui trình chế tạo deposition and etching under angle (DEA) - Các kĩ thuật và công nghệ cơ bản của DEA để chế tạo sợi nano silicon Chương 3 – Chế tạo sợi nano bằng phương pháp DEA và kết quả chế tạo - Chi tiết các bước chế tạo sợi nano silicon bằng phương pháp DEA - Kêt quả chế tạo Chương 4 – Khảo sát khả năng phát hiện DNA của cảm biến - Biến đổi bề mặt sợi silicon thích hợp cho việc gắn thụ thể - Đo đạc, phát hiện DNA của cây bắp chuyển gen. Kết luận Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN I. Lịch sử phát triển cảm biến sinh học (biosensor) Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì: “Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi.” Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học như enzym, các kháng thể, để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hoá chất. Do vậy cấu tạo của cảm biến sinh học bao gồm 3 thành phần cơ bản: thành phần hoá học, thành phần sinh học và thành phần vật lý. Hình 1: Mô hình cảm biến sinh học đầu tiên. Giáo sư Leyland D.Clark được biết như là người đi tiên phong trong lĩnh vực cảm biến sinh học. Năm 1956 ông công bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hoá. Những năm tiếp theo ông tiếp tục thực hiện rất nhiều thí nghiệm nhằm cố gắng mở rộng khả năng hoạt động của cảm biến như phát hiện được thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ chính xác của cảm biến. Vào năm 1962, tại hội nghị New York Academy of Science, ông đã thuyết trình một bài về cảm biến sinh học: “To make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometric) more intelligent by adding enzyme Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon 2 transducers as membrane enclosed sandwiches”. Ông đưa ra mô hình đầu tiên về cảm biến sinh học. Cảm biến sinh học theo mô hình của D.Clark bao gồm điện cực oxy hóa, trên đó có màng giữ enzyme glucose (glucose oxidase). Khi mật độ glucose trong môi trường phản ứng giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm một cách tương ứng. Dựa trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của nồng độ glucose trong môi trường cần kiểm tra. Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo lần đầu tiên công bố chi tiết về chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa enzyme đo điện thế, một cảm biến đo nồng độ urê dựa trên điện cực cố định enzyme urê (urease) bằng màng chất lỏng chọn lọc NH4+. Năm 1975 Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fibre-optic sensor) gắn các chất chỉ thị dùng để đo nồng độ CO 2 và O 2 . Cũng vào năm 1975, một số vi khuẩn cũng đã được sử dụng như những thành phần sinh học trên các điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn. Năm 1975 công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần đầu tiên biến ý tưởng của Clark thành hiện thực thông qua việc thương mại hóa các cảm biến sinh học. Sản phẩm đầu tiên là thiết bị phân tích glucose dựa trên hydrogen peroxide và đó cũng là cột mốc đầu tiên đánh dấu sự xuất hiện của các cảm biến sinh học trong đời sống. Vào năm 1982, Shichiri và các đồng nghiệp đã báo cáo và mô tả về cảm biến glucose in vivo, là loại cảm biến dạng kim đầu tiên cho các xét nghiệm dưới da. Trong thập kỉ vừa qua, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là các ngành công nghệ vật liệu và chế tạo nano , cảm biến sinh học thế hệ mới- cảm biến nano sinh học - cũng đạt được những tiến bộ vượt bậc. Trong cấu trúc của cảm biến nano sinh học, các điện cực hay phần nhạy của thiết bị truyền thống bây giờ được thay thế bằng các vật liệu và linh kiện nano có độ nhạy cao hơn. Ví dụ các điện cực micro trước đây được thay thế bằng các cấu trúc nano như ống nano cacbon hay sợi nano của vật liệu bán dẫn hoặc kim loại với độ nhạy ở mức đơn phân tử (single molecule) mà cấu trúc micro không có khả năng này. Ngoài ra, những thành tựu đột phá trong lĩnh vực sinh học phân tử và y sinh gần đây đã xác định được trên 140 chất đánh dấu sinh học (biological markers), giúp nâng cao đáng kể độ đặc hiệu của cảm biến sinh học nói chung. Và sự kết hợp các ưu việt của công nghệ nano [...]... DEA và các kĩ thuật cơ bản nói trên của công nghệ chế tạo vi điện tử, sợi nao silicon đã được chế tạo tại PTN CNNN, ĐHQG TP HCM Các thông số chi tiết cho việc chế tạo và các hình ảnh, tính chất điện của sợi nano chế tạo ra được trình bày trong chương tiếp theo 23 Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon CHƯƠNG 3 CHẾ TẠO SỢI NANO SILICON BẰNG PHƯƠNG PHÁP DEA VÀ KẾT QUẢ CHẾ TẠO... nhiều cảm biến nano sinh học đã và đang được nghiên cứu, phát triển trong thời gian qua và mỗi loại có những ưu điểm khác nhau Tuy nhiên trong luận văn này chúng tôi tập trung nghiên cứu về công nghệ chế tạo và ứng dụng của cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc của sợi nano silicon II Cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc của sợi nano (nanowire based biosensors) Sợi nano được định nghĩa là vật liệu ở dạng sợi... và các chất sinh học quan trọng khác như DNA, proteins, virut… bộ kít sợi nano đã và đang được các nhóm nghiên cứu và công ty đa quốc gia đầu tư, nghiên cứu, để thương mại hóa trong một vài năm tới [ref] Do đó mục tiêu của luận văn Thạc sỹ này là: Nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng của cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc nano silicon Công việc được thực hiện tại PTN CNNN, ĐHQG Tp.HCM 6 Nghiên cứu, chế. . .Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon (vật liệu và linh kiện nano với độ nhạy cao) với công nghệ sinh học (độ đặc hiệu cao của chất đánh dấu sinh học) đã chế tạo ra những thế hệ cảm biến mới có khả năng xác định nhanh, chính xác, với độ đặc hiệu cao các phần tử sinh học quan trọng như DNA, proteins, vi khuẩn, virut gây bệnh… Có rất nhiều cảm biến nano sinh học đã và đang... chiếu sáng và thời gian hiện để tạo ra các cửa sổ có chất lượng tốt nhất với loại cảm quang sử dụng 12 Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon Cr Hình 5: Mô hình mặt nạ Hình 6: Quy trình quang khắc Các giai đoạn cơ bản để tạo quang khắc: - Chuẩn bị bề mặt - Sấy sơ bộ - Phủ photoresist lên đế 13 Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon - Chuyển hình ảnh từ... sợi và dễ dàng hơn trong việc tạo điện cực kết nối mạch 7 Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon ngoài Tuy thế các thiết bị quang khắc nano nói trên đều rất đắt tiền, đi kèm với năng suất thấp, dẫn đến giá thành chế tạo linh kiện quá cao, hạn chế khả năng nghiên cứu cũng như ứng dụng rộng rãi của linh kiện sợi nano nói chung và cảm biến sợi nano nói riêng Hiện nay các nhóm nghiên. .. nano silicon có kích thước khoang 45 nm Hình ảnh SEM và AFM (14 c) cho thấy sợi nano silicon chế tạo ra thẳng, có bề mặt tương 27 Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon đối nhẵn, thích hợp cho việc chế tạo cảm biến sinh học Hiện nay bước ăn mòn khô đang được tiếp tục hoàn thiện, để nâng cao độ nhẵn của sợi chế tạo ra II.2 Tính chất điện Để khảo sát tính chất điện của sợi nano. .. chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon CHƯƠNG 2 QUI TRÌNH DEA VÀ CÁC KĨ THUẬT DÙNG ĐỂ CHẾ TẠO SỢI NANO SILICON I Qui trình Deposition and Etching under Angle (DEA) để chế tạo sợi nano silicon Với rất nhiều tính chất ưu việt như tính dẫn điện, tính chất quang, và tính siêu nhạy khi sử dụng làm cảm biến mà thiết bị và linh kiện truyền thống không có được, linh kiện và cảm biến xây dựng trên. .. việt của bộ kít sợi nano có thể được trình bày vắn tắt dưới đây: 3 Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học sợi nano silicon (d) Hình 2: Nguyên lí hoạt động và cấu trúc của bộ kít nano sinh học dựa trên sợi nano là sợi bán dẫn silic loại P có chứa các hạt dẫn mang điện dương Hai đầu sợi nano có các tiếp xúc điện (không mô tả trong hình vẽ) để cho dòng điện chạy qua sợi nano Trên bề mặt sợi được... sử dụng các kĩ thuật cơ bản của công nghệ micro mà PTN CNNN hiện có, để chế tạo sợi nano Silicon trên đế silicon Chíp chế tạo ra có các đơn sợi nano silicon, mỗi đơn sợi đều có điện cực nối ra mạch điều khiển mạch ngoài, thích hợp cho việc đo đạc, khảo sát và ứng dụng làm cảm biến đinh lượng sinh học sau này chế tạo được linh kiện sợi nano silicon (Si), có kích thước và tính chất phù cho 10 Nghiên cứu, . là: Nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng của cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc nano silicon . Công việc được thực hiện tại PTN CNNN, ĐHQG Tp.HCM. Nghiên cứu, chế tạo, ứng dụng cảm biến sinh học. công nghệ chế tạo và ứng dụng của cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc của sợi nano silicon. II. Cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc của sợi nano (nanowire based biosensors). Sợi nano được định nghĩa. này là: Nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc nano silicon . Đề tài được thực hiện, sử dụng các thiết bị chế tạo và đo đạc tại Phòng thí Nghiệm Công Nghệ Nano,