Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 1.1.1 Sơ lược về axit glutamic và vai trò của axit glutamic hiện Acid glutamic Trong đời sống hiện nay, axit amin nói chung và axit glutamic(L-AG) nói riêng có một ý nghĩa to lớn, nó có tự nhiên và có nhiều thực phẩm (rong biển) Axit glutamic được phát hiện và xác định năm 1866 nhà bác học người Đức Karl Heinrich Ritthausen Leopold L-AG là một axit amin quan trọng Công thức hóa học là : COOH CH-NH2 CH2 CH2 COOH Axit glutamic có trọng lượng phân tử 147,13 dalton, bị phân giải ở nhiệt độ 247249oC, điểm đẳng điện pH=3,22 Tan nước, không tan cồn, ete và một số dung môi Axit glutamic là loại acid amin thể có thể tổng hợp, có nhiều các loại thực phẩm protein động vật, thực vật rong biển, cà rốt, củ sắn, rỉ đường v.v Axit glutamic phân bố rộng rãi tự nhiên dưới dạng hợp chất và dạng tự Trong sinh vật, đặc biệt là vi sinh vật, axit glutamic được tổng hợp theo đường lên men từ nhiều nguồn cacbon 1.1.2 Vai trò của L-AG Ngày nay, việc nghiên cứu sản xuất axit glutamic được đẩy mạnh phát triển Người ta càng ngày càng sử dụng nhiều axit glutamic việc nâng cao sức khỏe và điều trị một số bệnh của người Nó đóng vai trò quan trọng quá trình trao đổi chất của người và động vật, việc xây dựng protit, xây dựng các cấu tử của tế bào Axit glutamic còn có thể tổng hợp nên các aminoaxit khác alanin, systein, prolin v.v ,tham gia chuyển amin, giúp thể tiêu hóa nhóm amin và tách NH3 khỏi thể Nó chiếm phần lớn thành phần protit và phần xám của não, biến đổi sinh hóa ở hệ thần kinh trung ương, tham gia trực tiếp vào chu trình SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Krebs, vì vậy y học, ngoài dùng trị liệu thần kinh, bệnh chậm phát triển, một số bệnh tim, teo bắp thịt, bổ sung dinh dưỡng sau phẫu thuật ra, người ta còn dùng để giảm thiểu nhiễm trùng và tăng cường miễn dịch sau phẫu thuật L-AG còn dùng làm nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số hóa chất quan trọng: N- acetylglutamat, là chất hoạt động bề mặt, VSV phân giải được, ít ăn da, dùng làm mỹ phẩm, xà phòng, dầu gội đầu v.v 1.2 1.2.1 Các phương pháp sản xuất axit glutamic Phương pháp tổng hợp hóa học Ứng dụng các phản ứng hóa học để tổng hợp nên axit glutamic và các aminoaxit khác từ khí thải Ưu điểm: tận dụng được các phế liệu của công nghiệp dầu hỏa Nhược điểm: đòi hỏi kỹ thuật cao, việc tách L-axit glutamic khó khăn nên làm tăng giá thành sản phẩm 1.2.2 Phương pháp thủy phân protit Phương pháp này sử dụng các hóa chất hoặc fecmen để thủy phân một nguồn protit nào đó một hỗn hợp các aminoaxit, từ đó tách axit glutamic Ưu điểm: dễ khống chế quy trình sản xuất, có thể áp dụng cho các sở thủ công Nhược điểm: sử dụng nguyên liệu protit hiếm và đắt, cần nhiều hóa chất và thiết bị ăn mòn, hiệu suất thấp, giá thành cao 1.2.3 Phương pháp lên men Phương pháp này lợi dụng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp các axit amin từ nguồn glutxit và đạm vô Tất cả các loài VSV có một số đặc điểm sau: Hình dạng tế bào từ hình cầu đến hình que ngắn; Vi khuẩn Gram(+); Hô hấp hiếu khí; SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Không tạo bào tử; Không chuyển động được, không có tiên mao; Biotin là yếu tố cần thiết cho sinh trưởng và phát triển; Tích tụ một lượng lớn glutamic từ hydrat cacbon và NH 4+ môi trường có sục không khí; Nhiệt độ lên men giữ ở 28oC và trì pH=8 bằng cách bổ sung ure Nếu không được sục khí thì sản phẩm tạo thành không phải là axit glutamic mà là lactan Khi sử dụng nguyên liệu lên men là rỉ đường thì cần phải bổ sung các chất kháng biotin để kiểm soát sự sinh trưởng của vi sinh vật Ưu điểm: không sử dụng nguyên liệu protit, hiệu suất cao, giá thành thấp, tạo axit glutamic dạng L có hoạt tính sinh học cao 1.2.4 Phương pháp kết hợp Đây là phương pháp kết hợp giữa tổng hợp hóa học và vi sinh vật học Phương pháp này nhanh yêu cầu kỹ thuật cao, chỉ dùng để nghiên cứu SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Chương 2: Quy trình công nghệ sản xuất L- axit glutamic 2.1 Sơ đồ quy trình công nghệ Rỉ đường Cân bằng môi trường Lên men Dịch lên men Phương pháp trao đổi ion Lọc Pha loãng HCL 31% Điều chỉnh pH (4,5- 5,5) Trao đổi ion NaOH 4% Nhả hấp phụ SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê hay NaCl 4% Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Làm lạnh, kết tinh 12oC, tg=18h Nước cái Ly tâm Độ khô 17% Sấy Đóng gói L- AG thô 2.2 Thuyết minh quy trình Rỉ đường mía là phần còn lại của dung dịch đường sau đã tách phần đường kính đã kết tinh Thành phần chính của rỉ đường là: đường 62%, các chất phi đường 10%, nước 20% Nước rỉ đường gồm phần lớn ở trạng thái tự và một số ít ở trạng thái liên kết dưới dạng hydrat Đường rỉ đường bao gồm: 25- 40% sacaroza, 15- 25% đường khử( glucoza và fructoza), 3- 5% đường không lên men được Có nhiều phương pháp xử lý rỉ đường nhằm loại các hợp chất có hại CO 2, chất keo, chất màu, axit hữu dễ bay và VSV tạp nhiễm Lên men là khâu có tính chất quyết định nhất đối với toàn bộ dây chuyền sản xuất Trong công đoạn này có giai đoạn nhỏ là nuôi giống cấp I, giống cấp II và lên men lớn Ngoài còn có những công đoạn lọc khí, xử lý ure, xử lý dầu khử bọt Quá trình nuôi giống được tiến hành theo các bước sau: SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Giống gốc cấy truyền ống thạch nghiêng đời cấy truyền ống thạch nghiêng đời lên men bình lắc( giống cấp 1) nuôi giống cấp lên men chính Bảo quản giống môi trường thạch nghiêng Khi cần, cấy tiếp chúng vào mặt thạch Tiếp chủng xong bảo quản tủ lạnh 3- tháng Sau 3- tháng thuần hóa, nhặt bỏ những yếu Để bảo đảm giống dùng sản xuất được khỏe, ta dùng phương pháp phân ly và pha loãng Ta lấy nước vô trùng rửa, pha loãng, dùng kính hiển vi soi, chọn khỏe nhất Chọn lọc: lấy nhóm đơn khuẩn cho vào môi trường thạch nghiêng để 24h, ở 32oC Cho sang bình 1000ml đưa vào bình tam giác 250ml có chứa 200- 250ml môi trường, lắc ở nhiệt độ 32 oC 12h Sau đó lấy 1ml cho vào bình tam giác 250ml chứa 15ml môi trường lên men, giữ 32oC 48h Sau đó lên men cấp Trong các thiết bị lên men sản xuất có đủ các chất cho quá trình lên men và hiếu khí môi trường Quá trình lên men cho không khí vào và khuấy trộn, lên men tạo bọt, đó phải dùng dầu để khử bọt Tất cả các chất trước vào thùng lên men, que cấy, ống nghiệm, bình tam giác… đều phải vô trùng thật sạch sẽ và được trùng nồi áp lực Môi trường đã trùng phải để nguội phòng vô trùng Chuẩn bị xong, dùng que cấy giống từ ống gốc sang ống thạch nghiêng để vào tủ ấm 24h cho khuẩn lạc phát triển, ta được giống đời I, cấy truyền sang ống thạch nghiêng một lần nữa, ta được giống đời II và đủ lượng cho vào bình tam giác đã có sẵn môi trường đưa lên men máy lắc 12h được giống cấp I Lên men cấp II: chuẩn bị môi trường và thiết bị quá trình lên men chính, trùng môi trường 120oC 30 phút, quá trình nuôi giống khống chế ở nhiệt độ 32oC, lượng không khí cho vào khoảng 850- 1100 lít/giờ Lên men lớn( lên men cấp III): Mục đích: thông qua hoạt động sống của vi khuẩn những điều kiện thích hợp để chuyển hóa đường glucoza và đạm vô thành axit glutamic SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Giai đoạn đầu: 8- 12h gọi là giai đoạn sinh khối Giai đoạn này các chất đường đạm vô và hữu cơ, các chất muối khoáng, vitamin và các chất sinh trưởng có môi trường thẩm thấu vào TB vi khuẩn làm cho vi khuẩn lớn lên, đạt kích thước cực đại và bắt đầu sinh sản, phân chia Biểu hiện: nhiệt độ tăng vừa phải, càng về cuối giai đoạn tốc độ tăng nhiệt độ càng nhanh, pH tăng dần từ 6,5- 6,7 lên 7,5- 8, bọt tạo thành tăng dần, lượng đường tiêu hao tăng dần, lượng tế bào vi khuẩn tăng dần, hàm lượng axit glutamic chưa có hoặc rất ít Giai đoạn giữa: giai đoạn này giữ cho tế bào không tăng thêm nữa hoặc tăng rất ít Chủ yếu đường và đạm vô thẩm thấu qua màng tế bào vi khuẩn và các quá trình chuyển hóa bởi các men để tạo axit glutamic tế bào Lượng axit glutamic tạo thành lại hòa tan vào các môi trường làm cho pH môi trường giảm dần, CO bay nhiều, bọt tăng ào ạt Giai đoạn cuối: những giờ còn lại tất cả các biểu hiện đều giảm dần cho đến ki hàm lượng đường chỉ còn dưới 1% thì lên men kết thúc Để đảm bảo quá trình lên men đạt hiệu quả cao phải chú ý khống chế các điều kiện sau: Nhiệt độ giữ 32oC, áp suất 1kG/cm2, lượng không khí 30- 40 m3/1h cho 1m3 môi trường, bọt nhiều phải tiếp giống để phá bọt tạo điều kiện cho CO thoát ngoài dễ dàng Phương pháp trao đổi ion: phương pháp này chủ yếu dựa vào tính chất của các cationit có khả giữ lại bề mặt của nó các anion, đó chủ yếu là các anion glutamate Khi quá trình trao đổi đã bão hòa, tiến hành quá trình nhả NaOH để thu axit glutamic và tạo thành axit glutamate natri Mục đích của công đoạn trao đổi ion là tách lấy axit glutamic khỏi dịch lên men Người ta lợi dụng tính chất hạt nhựa polyetylen sunfuric sau đã được cation hóa có khả giữ lại bề mặt của nó anion Sau đó lại dùng NaOH để tách anion khỏi hạt nhựa Lọc: mục đích: tách dung dịch hòa tan khỏi các tạp chất Để tiến hành lọc được tốt, lượng axit ít bay ảnh hưởng sức khỏe đến người và môi trường axit ít ăn mòn thiết bị, ta phải làm nguội dung dịch đến nhiệt độ nhỏ 50oC SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Điều chỉnh pH: tùy vào pH, AG có thể tồn tại dung dịch ở dạng các ion có hóa trị khác Vì vậy ta nên sử dụng dịch men ở pH nào để vừa đỡ tốn HCl 31% dùng để hạ pH dịch men kết thúc, vừa đảm bảo có hiệu suất thu hồi AG cao Nhả hấp phụ: dịch đạt 45oC thì ngừng cho nước nóng và bắt đầu cho NaOH 4% cũng đã được gia nhiệt vào để tách axit glutamic, lúc này dịch thải vẫn được thu hồi để pha mẻ sau đồng thời phải liên tục kiểm tra pH, độ Baumé, vì axit glutamic theo dịch tăng lên nhanh chóng, độ Baumé đạt oC thì lập tức thu hồi axit glutamic Làm lạnh, kết tinh: Toàn bộ dung dịch axit glutamic thu được đưa về thùng kết tinh, cho cánh khuấy hoạt động liên tục để ngăn axit glutamic kết tinh quá sớm, tinh thể nhỏ, hiệu suất thấp Cho HCl 31% vào để tạo điểm đẳng điện và mở nước lạnh để giảm nhiệt độ, đó cánh khuấy tiếp tục hoạt động làm cho axit glutamic kết tinh to, tơi và xốp Tám giờ sau thì ngừng khuấy, còn nhiệt độ thì cho hạ từ từ đến nhiệt đội không khí Sau khoảng thời gian thì quá trình làm lạnh kết tinh kết thúc Ở dung dịch axit glutamic được chia làm pha: Pha rắn: axit glutamic đã kết tinh lắng xuống dưới Pha lỏng: gồm nước và số ít axit glutamic không kết tinh hòa tan vào, gọi là nước cái được đưa trao đổi ion lại Ly tâm: sau làm lạnh, kết tinh ta được axit glutamic ẩm Mục đích của ly tâm là để loại bớt nước cái và chất không kết tinh, tiếp tục phun nước rửa sạch các chất bám xung quanh bề mặt tinh thể Sấy: Axit glutamic hút ẩm rất nhanh nên sau ly tâm, ta phải sấy các tủ sấy có nhiệt 80oC, cứ 30 phút đảo trộn lần, đến độ ẩm mì chính còn lại dưới 0,5% thì kết thúc sấy Thường sấy mất khoảng giờ Đóng gói: mì chính sau sàng phân loại đem cân và đóng gói bao túi polyetylen lần Từng túi lớn được bọc kỹ bằng giấy chống ẩm và đóng kín hòm gỗ đưa nhập kho SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư Chương 3: Tính cân bằng vật chất 3.1 Giả thuyết Nguyên liệu dịch lên men: Năng suất 500(kg/ ca) Phương pháp tinh chế: Trao đổi ion Địa điểm nhà máy: Hòa Khánh STT CÔNG ĐOẠN HIỆU SUẤT THIẾT BI Khới lượng L-AGbđ THƠNG SƠ W, NỜNG ĐÔ 40(g/l) HAO HỤT Lọc dịch 0,8% Pha loãng 0,5% Trao đổi ion 74% 2% Làm lạnh- kết tinh 85% 0,5% Ly tâm 87% 1% 0,5% Sấy 11% 1% Sàng- bao gói 0,5% Số ca làm việc/ ngày: Số giờ làm việc/ ca: 3.2 Công đoạn lọc dịch Mdd = 500(kg/ca) d= 1050kg/m3 V= = 1000= (lít) Trong lít dịch lên men có 40g L-AG SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư => Số gam L-AG có lít: Mnguyên chất = 40= 19047,61905(g/ca) = 19,0476(kg/ca) Hao hụt: 0,8% Hao hụt: 0,8% Lượng axit glutamic còn lại sau Lượng axit glutamic còn lại sau công đoạn lọc dịch: công đoạn lọc dịch: 19,0476 =18,8952(kg/ca) 500 = 496(kg/ ca) 3.3 Công đoạn pha loãng Hao hụt: 0,5% Hao hụt: 0,5% Lượng axit glutamic còn lại sau Lượng axit glutamic còn lại sau công đoạn pha loãng: công đoạn pha loãng: 496 =987,04(kg/ca) 18,8952 =18,8007(kg/ca) 3.4 Công đoạn trao đổi ion Hiệu suất trao đổi: 74% Hiệu suất trao đổi: 74% Hao hụt: 2% Hao hụt 2% Lượng axit glutamic còn lại sau Lượng axit glutamic còn lại sau công đoạn trao đổi ion: công đoạn trao đổi ion: 987,04= 18,8007 =13,6343(kg/ca) 715,8014(kg/ca) SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư 3.5 Công đoạn làm lạnh- kết tinh Hiệu suất: 85%, hao hụt: 0,5% Hiệu suất: 85%, hao hụt: 0,5% Lượng axit glutamic còn lại sau Lượng axit glutamic còn lại sau công đoạn làm lạnh- kết tinh: công đoạn làm lạnh- kết tinh: 715,8014=605,389 13,6343 =11,5312(kg/ca) (kg/ca) 3.6 Ly tâm Hiệu suất: 87%, Wtrước: 17% Hiệu suất: 87% Wsau: 11%, Hao hụt: 1% Lượng axit glutamic trước ly tâm: m==13,893(kg/ca) Lượng axit glutamic còn lại sau Lượng axit glutamic còn lại sau ly tâm: ly tâm: 13,893= 11,5312 =9,9318(kg/ca) 11,1593(kg/ca) 3.7 Sấy Hao hụt: 1%, Wtrước: 11% Hao hụt: 1% Wsau: 0,5% 11,1593=9,8819 9,9318=9,8325(kg/ca) (kg/ca) SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê Đồ án công nghệ sinh học GVHD: Trần Thị Ngọc Thư 3.8 Sàng- bao gói Hao hụt: 0,5% 9,8819=9,8325(kg/ca) 9,8325 =9,7833(kg/ca) 3.9 Tổng kết ST T Công đoạn Khối lượng Mdd kg/ngày kg/ca kg/h Khối lượng Mnguyên chất kg/ngày kg/ca kg/h Nguyên liệu ban đầu 1000 500 62.5 38,0952 19,0476 2,38095 Lọc dịch 992 496 62 37,7904 18,8952 2,3619 Pha loãng 1974,08 987,04 123.88 37,6014 18,8007 2,3501 Trao đổi ion 715,8014 89,4752 27.2686 13,6343 1,7043 Làm lạnh, kết tinh 1431,602 1210,778 605,389 75,6736 23,0624 11,5312 1,4414 Ly tâm 22,3186 11,1593 1,3949 19,8636 9,9318 1,2415 Sấy 19,7638 9,8819 1,2352 19,665 9,8325 1,2291 Sàng, bao gói 19,665 9,8325 1,2291 19,5666 9,7833 1,2229 SVTH: Trần Hoàng Vi Khuê ... Ở dung dịch axit glutamic được chia làm pha: Pha rắn: axit glutamic đã kết tinh lắng xuống dưới Pha lỏng: gồm nước và số ít axit glutamic không kết tinh hòa tan vào, gọi là... tiến hành quá trình nhả NaOH để thu axit glutamic và tạo thành axit glutamate natri Mục đích của công đoạn trao đổi ion là tách lấy axit glutamic khỏi dịch lên men Người ta lợi... Các phương pháp sản xuất axit glutamic Phương pháp tổng hợp hóa học Ứng dụng các phản ứng hóa học để tổng hợp nên axit glutamic và các aminoaxit khác từ khí thải Ưu điểm: