Đang tải... (xem toàn văn)
Berberin là một Alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin
đặt vấn đề Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1]. Berberin đợc biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều trị bệnh lỵ. Thuốc đợc sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn, không ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của vi khuẩn có ích ở ruột. Hiện nay trên thị trờng có các dạng bào chế của Berberin nh: thuốc nhỏ mắt, viên nén, viên bao. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lợng nguyên liệu làm thuốc cũng nh thành phẩm là rất quan trọng. Dợc điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại UV- VIS, dợc điển Trung Quốc (2005) định lợng Berberin bằng HPLC. Để có cơ sở lựa chọn phơng pháp định lợng Berberin thích hợp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dợc điển Việt Nam III với những mục tiêu sau: Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III So sánh hai phơng pháp định lợng trên để tìm phơng pháp thích hợp cho việc định lợng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lợng thuốc trong nớc. PHầN I. TổNG QUAn 1 1.1. vài nét Về BERBERIN: 1.1.1. Cấu trúc: Beberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung protoberberin[1]. Isoquinolin còn đợc gọi là benzo[c] pyridin hay 2- benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic[18] Cấu trúc của isoquinolin Công thức cấu tạo: Công thức phân tử: C 20 H 18 NO 4 + PTL: 336.36 Tên khoa học : 5,6 dihydro 8,9 dimethoxy 1,3 dioxa 6a azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6] 1.1.2. Nguồn gốc: Berberin thờng có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin có nhiều trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn phần [9]. Berberin thờng có lẫn các tạp chất alcaloid khác nh: palmatin, jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5 % [6],[13]. 2 1.1.3. Tính chất - Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. Tan trong nớc nóng, khó tan trong ethanol và nớc lạnh, rất khó tan trong cloroform, không tan trong ether.[6] 1.5. Tác dụng dợc lý: - Berberin có tác dụng kháng vi trùng nh: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu và liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đờng ruột) [12], [17]. - Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽ không ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của hệ vi khuẩn có ích ở ruột, khi dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đờng ruột [17]. - Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đờng, ức chế cơn nhịp nhanh thất, giảm viêm cho ngời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin[17]. Chỉ định: [9],[12],[17] - Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt. - Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng, gió, lạnh, bụi, khói) và điều trị bệnh đau mắt hột. - Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas. 1.1.6. Chống chỉ định: [17] - Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin - Ngời dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp) 1.1.7. Dạng thuốc và hàm lợng: [11] 3 - Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lợng 10 mg, hoặc 50-100 mg/ viên - Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói) 1.2. Một số phơng pháp định lợng Berberin: 1.2.1. Phơng pháp thể tích: [5], [13] Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào trong cốc với 150ml nớc đang sôi. Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml. Lấy chính xác 50ml dung dịch kali dicromat 0,1N rồi thêm nớc tới vạch. Lắc đều trong 5 phút, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 100ml dịch lọc cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau đó thêm 10 ml dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng tối trong 10 phút. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm tơng đơng thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi màu xanh biến mất thì dừng. Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện. 1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tơng ứng với 12,39 mg C 20 H 18 NO 4 Cl. 1.2.2. Phơng pháp đo UV-vis Phơng pháp 1:[6]. * Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm và hòa tan trong 200ml nớc bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000ml. Lấy 10ml dung dịch này pha loãng với nớc đến 100ml. * Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc thử chuẩn đã sấy khô ở 110 0 C trong 4 giờ, hòa tan trong nớc. Thêm 10ml dung dịch acid sulfuric 1N và thêm nớc vừa đủ 1000ml. * Đo độ hấp thụ: Đo At và As của dunh dịch thử và dung dịch chuẩn ở b- ớc sóng 421 nm. * Cách tính: Lợng ( mg) của C 20 H 18 NO 4 Cl đợc tính bằng công thức sau: 4 a As At P ìì= 006,1 1 a: khối lợng ( mg) kali dichromat. Phơng pháp 2 [6] Xác định hàm lợng berberin clorid trong viên nén. * Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lợng trung bình và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lợng bột viên tơng đơng với khoảng 80 mg berberin clorid, thêm 10ml nớc để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng 200ml nớc sôi, khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nớc tới vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy chính xác 5ml dung dịch trong ở trên đem pha loãng với nớc cất vừa đủ 100ml. * Dung dịch chuẩn : pha tơng tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin clorid. * Mẫu trắng: nớc cất. * Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều kiện tại bớc sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm. 1.2.3. Phơng pháp cân [5] áp dụng để định lợng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo tủa của berberin với acid picric. Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lợng bột viên t- ơng ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml, thêm khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm methanol đến ngấn. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu. Lấy đúng 100ml dịch lọc. Làm bay hơi cho đến khô trên cách thủy, thêm 150ml dung dịch NaOH 0,1N và 90ml nớc, đun nóng. Lắc kỹ để hòa tan. Để nguội rồi lọc qua giấy lọc đã thấm ớt. Rửa phễu và giấy lọc 3 lần, mỗi lần 10ml nớc. Gộp dịch lọc và nớc rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N rồi tiếp tục cho ngay và từ từ 30ml dung dịch bão hòa acid picric ( TT). Lắc đều. 5 Để yên qua một đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đờng kính lỗ xốp 10 16 àm ( đã cân bì) để lấy tủa. Rửa tủa 3 lần với nớc cất ở khoảng 15 0 C, mỗi lần 15ml nớc, hút kiệt nớc rồi sấy khô phễu và tủa ở 100 0 C đến khối lợng không đổi. Khối lợng tủa xác định là P (g). 1 g tủa tơng ứng với 0,6586 g C 20 H 18 NO 4 Cl. 1.2.4. Phơng pháp HPLC Phơng pháp 1:[14], [15]. * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x 4 mm) đợc nhồi bởi hạt silicagel đã đ- ợc octadecylsilan hóa có đờng kính 5 àm. - Nhiệt độ cột: 40 0 C. - Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong 1000 ml hỗn hợp dung môi nớc và acetonitril (1:1). - Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lu của berberin khoảng 10 phút. - Detector UV ở bớc sóng 345 nm. - Thể tích tiêm: 10 àl. - Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung dịch này giống nhau. * Tiến hành: Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng berberin trong chế phẩm. * Cách tính: Lợng W t (mg) của berberin clorid (C 20 H 18 ClNO 4 ). W t = W s x (A t / A s ) W s = Lợng (mg) của berberin chuẩn, tính theo lợng khan. 6 Phơng pháp 2: [13] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột đợc nhồi bởi các hạt silicagel đã đợc octadecylsilan hóa. - Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2% triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric] và acetonitril (60:40). - Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút. - Detector UV ở bớc sóng 263 nm. - Thể tích tiêm: 20 àl - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 32 àg/ml * Tiến hành: Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng berberin có trong chế phẩm. Phơng pháp 3: [16] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( 5 àm, 25 cm x 4,6 mm) - Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l acetonitril ( 58: 42). - Tốc độ dòng: 1ml/phút. - Detector UV ở bớc sóng 349 nm. * Tiến hành: Tơng tự nh 2 phơng pháp HPLC đã trình bày ở trên. 1.3. Tổng quan Phơng pháp hplc 1.3.1. Nguyên tắc Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất 7 cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị trên màn hình hoặc đa ra máy in. [8] 1.3.2. Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách đợc các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ. [8], [11] 1.3.3. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký: Kết quả của quá trình sắc kí đợc detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ( hình 1): t t W b2 0.5-2 W 0.5-1 W b1 W R2 R2 t' t' R1 R1 t o Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trng 8 Trong đó : t o (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách t R (thời gian lu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích đợc bơm vào cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích. t R (thời gian lu thực ) = t R - t o. W 0,5 : Độ rộng pic ở nửa chiều cao W b : Độ rộng đáy pic. 1.3.2.1. Hệ số dung lợng k [8] Nếu k' nhỏ thì t R cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ đợc tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. 1.3.2.2 Độ chọn lọc (selectivity - factor) = tt tt 'k 'k 01R 02R 1 2 = (k 2 ' > k 1 ' ) [4], [8] khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 2. 1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo công thức: = R ( ) ( ) = + = + + 'k1 'k ww tt ww tt B B A2/1B2/1 A,RB,R AB A,RB,R 1 4 N 18,12 [4], [8] Độ phân giải cơ bản đạt đợc khi R = 1,5 1.3.2.4. Hệ số bất đối AF Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó đợc tính theo công thức: 9 1 t t t tt t 't 'k 0 R 0 0R 0 R = == a2 AF w 20/1 = [4], [8] Trong đó: W 1/20 : là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lợng đợc chấp nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tợng kéo đuôi càng rõ. Hiện tợng đỉnh kéo đuôi (tailing peak) có thể là do tơng tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hoặc cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trớc (fronting peak) có thể do lợng mẫu đa vào quá lớn so với năng lực cột [7]. 1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N Đặc trng cho hiệu lực cột. N = 16 w t B R 2 hay N=5,54 w t B2/1 R 2 [4], [8] Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H đợc tính bằng công thức: = H N L 1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8] Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau: a/Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0 - 400 bar) a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi 10 [...]... kỹ thuật định lợng khác nh: phơng pháp đờng chuẩn, phơng pháp thêm đờng chuẩn, phơng pháp chuẩn độ đo quang, phơng pháp định lợng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ Phần 2: thực nghiệm và kết quả 2.1 Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử: 2.1.1.1 Đối tợng nghiên cứu: Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lợng 83,3% do Viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp Berberin. .. So sánh 2 phơng pháp trên 2.1.2.2 Phơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn ph- ơng pháp phân tích Bằng thực nghiệm, dựa vào kết quả thu đợc, xử lý thống kê và rút ra kết luận 17 Phơng pháp sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 2.1.2.3.Phơng pháp xử lý số liệu thống kê: Dữ liệu thu đợc đợc xử lý bằng phơng pháp. .. = n 1 + Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lợng của hai phơng pháp khác nhau : X X S 1 T= p 1 + 2 1 n1 n 2 (X1> X 2 ) với S ( n 1) S + ( n 1) S n +n 2 2 p = 1 1 1 2 2 2 2 n + 2 T < t /2 n : giá trị trung bình kết quả định lợng của hai phơng 1 2 pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê T> n t 1 + /2 n 2 2 : giá trị trung bình kết quả định lợng của hai phơng pháp khác nhau có ý... 86,48 83,30 Theo kết quả ở bảng 1, ta có: Giá trị trung bình: X = 86,24% Độ lệch chuẩn S = 0,324 : Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): X(%) = 0,40 Độ lệch chuẩn tơng đối: RSD = 0,37% Kết luận: Hàm lợng Beberin clorid trong bột nguyên liệu là 86,24% 0,40% 2.2.2 Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin clorid nguyên liệu bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III... lợng % Berberin clorid có trong mẫu chuẩn At : Độ hấp thụ của dung dịch thử Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn mt : Khối lợng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử mc : Khối lợng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đã cân để pha dung dịch chuẩn Tiến hành định lợng 5 mẫu Kết quả ghi trong bảng 1 Bảng1 : Kết quả định lợng Beberin clorid trong nguyên liệu. .. nghiệm : 2.2.1 Định lợng Berberin clorid nguyên liệu bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III * Cách tiến hành : + Dung dịch thử : Cân 0,200 g chế phẩm và hoà tan trong 200 ml nớc bằng cách đun nóng Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000 ml Lấy 10 ml dung dịch này pha loãng với nớc đến 100 ml (C = 20 à g/ml) * Do cú sn berberin, mt khỏc d nh ỏp dng phng phỏp ny cho c berberin trong cỏc... Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml + Cốc có mỏ: các loại 100; 200; 500 + Pipet chính xác, pipet thờng, đũa thủy tinh + Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 àm 2.1.2 Phơng pháp nghiên cứu: 2.1.2.1 Chỉ tiêu nghiên cứu: Phân tích mẫu thử bằng phơng pháp HPLC và phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV- VIS Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của hai phơng pháp. .. bng berberin chun 19 + Dung dịch chuẩn đợc pha tơng tự dung dịch thử , dùng chất đối chiếu berberin clorid + Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện tại bớc sóng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nớc cất, cốc đo dày 1 cm * Cách tính kết quả : Theo phơng pháp so sánh, hàm lợng phần trăm đợc tính theo công thức : A ìm A ìm t c c C% = ì C t Trong đó : C% : Hàm lợng % Berberin. .. để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2 phơng pháp thí nghiệm khác nhau : Ftn = S S 2 1 2 ; trong đó S1 > S2 2 Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phơng pháp khác nhau có ý nghĩa thống kê 18 Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phơng pháp khác nhau có ý nghĩa thống kê Ftn . Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN. phơng pháp định lợng Berberin thích hợp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo