CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA 1.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men củavi sinhvật đốivới nguồn carbohydrate cụ thể (Glucose, Lactose, Xylose…) kếthợp vớimôitrường kiểmtrakhả năng sinh acid hoặc sinh acid và sinh hơi. 1.2. Sảnphẩmcuốicùngcủa quá trình lên men carbohydrates: • các loại acid như: lactic acid, acetic acid,…, •mộtvàiloạirượunhư: ethyl alcohol…, •Xêton •vàhailoạihơi là: carbon dioxide, hydrogen. 1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE 1.3. Môi trường: Carbohydrate fermentation broth Chứa3 thànhphầncănbản: ¾ (0.5 - 1.0)% carbohydrate kiểm tra (ví dụ: lactose hoặc glucose…), ¾ Chấtchỉ thị pH (Xem phần1.4). ¾ Môi trường dinh dưỡng để hầuhếtcácvi sinhvậtcóthể tăng trưởng dù vi sinh vật đócókhả năng lên men đường hay không. 1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE 1.4. Chấtchỉ thị pH: Phenolsulfonphthalein (C 19 H 14 O 5 S) 8.4 – đỏ hồng nhạt 6.8 - vàng7.9Phenol red 2- Methylamiophenazine (C 15 H 17 N 4 Cl) 8.0 - vàng6.8 - đỏ7.5Neutral red 4’ – Dimethylaminoazobenzene- 2-carboxylic acid (C 15 H 15 N 3 O 2 ) 6.0 - vàng4.4 - đỏ5.0Methyl red Dibromophenolsulfonphthalein (C 27 H 28 O 5 SBr 2 ) 7.6 – Xanh đậm6.0 - vàng 7.0 – xanh lá cây Bromthymol blue Dibromo-o- cresolsulfonphthalein (C 21 H 16 O 5 SBr 2 ) 6.8 - tím5.2 - vàng6.3 –tím Bromcresol purple Acid fuchsin8.0 – vàng nhạt5.0 - hồng 7.2 – không màu Andrade’s Thành phầnhóahọcpH kiềmpH acid pH môi trường Chấtchỉ thị pH 1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE 2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI) 2.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kếthợpvớimôitrường tăng trưởng cănbản, có hoặc khôngcósinhhơi và hydrogen sulfide (H 2 S). 2.2. Môi trường Glucose hay Galactose Chu trình Krebs Hiếu khí CO 2 + H 2 O + năng lượng 2.3. Sinh hóa • • S S ử ử d d ụ ụ ng ng lactose lactose • • S S ử ử d d ụ ụ ng ng glucose ( glucose ( đi đi ề ề u u ki ki ệ ệ n n hi hi ế ế u u kh kh í í - - m m ặ ặ t t nghiên nghiên ) ) KIA •1% Lactose • 0.1% Glucose TSI •1% Lactose 1% Sucrose • 0.1% Glucose Chấtchỉ thị pH: Phenol red Lactose β - Galactosidase Glucose + Galactose Đáy Nghiên 2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI) • • S S ử ử d d ụ ụ ng ng glucose ( glucose ( đi đi ề ề u u ki ki ệ ệ n n k k ỵ ỵ kh kh í í – – đ đ á á y y ) ) Con Con đư đư ờ ờ ng ng Embden Embden - - Meyerhof Meyerhof Glucose hoặc Galactose Con đường Embden-Meyerhof Kỵ khí Các acid hữucơ Các aldehyde Các loạirượu CO 2 + H 2 Năng lượng 2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI) • • Không Không lên lên men lactose men lactose v v à à glucose glucose Peptone Hiếukhí Kỵ khí Ammonia (NH 3 ) Æ Kiềm Vi khuẩn(môitrường acid) + Sodium thiosulfate H 2 S gas H 2 S + ion sắt Sắtsulfide (không tan tạotủamàuđen) • • Sinh Sinh hydrogen sulfide (H hydrogen sulfide (H 2 2 S) S) 2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI) Đáy ống nghiệm • Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose) •Màuđỏ/không đổi màu: glucose âm tính (không lên men glucose) •Màuđen: sinh H 2 S •Vỡ thạch: sinh hơitừ glucose Mặtnghiên: • Màu vàng: lactose và/hoặcsucrose dương tính (lactose và/hoặcsucrose đượcsử dụng) •Màuđỏ/không đổi màu: lactose và sucrose âm tính (lactose và sucrose không đượcsử dụng) 2.4. Đọckếtquả 2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI) 3. DECARBOXYLASE TEST (LTSINE-ORNITHINE- ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE) 3.1. Decarboxylase test (lysine-ornithine-arginine). 3.1.1. Nguyên tắc: Sử dụng để phát hiệnvi khuẩn sinh các ezyme decarboxylase, các enzyme này tương tác với các amino acid có gốc carboxyl (- COOH) ở cuối, tạo thành amine hay diamine và carbon dioxide (CO 2 ). [...]... năng sống và tái sinh của vi sinh vật trong môi trường chứa potassium cyanide 10.2 Môi trường: KCN broth 10.3 Cơ sở sinh hóa: - Hầu hết các vi sinh vật hiếu khí đều có enzyme cytochrome oxidase, nhờ enzyme này mà vi sinh vật sử dụng oxygen là chất nhận điện tử cuối cùng để khử oxygen phân tử thành hydrogen peroxide (H2O2) - Vi sinh vật kỵ khí không có khả năng sống khi có sự hiện diện của oxygen trong... Nguyên tắc: Phát hiện vi sinh vật có sinh enzyme coagulase, coagulase có tác dụng làm ngưng kết các thành phần của huyết tương tạo thành các khối đông huyết tương 16.2 Thuốc thử: Huyết tương thỏ 16.3 Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 0,5 mL huyết tương thỏ không pha loãng, bổ sung 0,5 mL dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc Xoay nhẹ ống để trộn đếu vi sinh vật Ủ ống nghiệm ở 370C... NGHIỆM CAMP 17.1 Nguyên tắc: Phản ứng CAMP là phản ứng phối hợp giữa nhân tố protein tiết ra bởi vi sinh vật với nhân tố β-hemolysin tiết ra bởi chủng Staphylococcus aureus gây ra hiện tượng làm tan hồng cầu của cừu trên môi trường thạch máu Nhân tố CAMP có vai trò tăng cường hoạt tính phospholipase C xúc tác thủy phân thành phần chủ yếu của mảng hồng cầu cừu là sphingomyelin của β-hemolysin Trong thử... phút 15 THỬ NGHIỆM CATALASE 15.1 Nguyên tắc: Phát hiện enzyme catalase của vi sinh vật, catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2 15.2 Thuốc thử: hydrogen peroxide (H2O2) 30% 15.3 Tiến hành: Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiếm kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trên phiếm kính, ghi nhận sự sủi bọt nếu có 15.4 Đọc kết quả: - Dương... Malonate ức chế phản ứng Phá vở tạm thời chu trình Krebs Không có khả năng tăng trưởng trừ khi vi sinh vật có thể sử dụng malonate là nguồn carbon duy nhất 8 MALONATE TEST 8.5 Đọc kết quả: – Dương tính: Màu xanh dương đậm (kiềm) – Âm tính: Màu xanh lá cây 9 CITRATE TEST 9.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất trong quá trình biến dưỡng của vi sinh vật 9.2 Môi trường:... (pH=6.0) 7 VOGES-PROSKAUER (VP) TEST 7.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật 7.2 Môi trường: MR-VP Broth 7.3 Thuốc thử: - Naphtol, (chất tăng cường màu) - KOH 40%, (chất oxi hóa) 7.4 Phản ứng: Glucose + ½ O2 2,3-butanediol 2,3-butanediol + H2O + 2 CO2 Oxi hóa 2,3-butanediol dehydrogenase Acetoin 7 VOGES-PROSKAUER (VP) TEST... nitrate thành nitrite hoặc sinh hơi nitrogen tự do của vi sinh vật 14.2 Môi trường: Nitrate broth 14.3 Thuốc thử: Thuốc thử A: - α-Naphthylamine - Dimethyl-α-naphthylamine Thuốc thử B: Sulfanilic acid Phản ứng: NO3- + 2 e- + 2 H+ Nitratase (Nitrate) 2NO3- + 10 e- + 12 H+ (Nitrate) Sulfanilic acid (không màu) + HNO2 NO2- + H2O (Nitrite) Nitratase N2+ 6 H2O sulfanilic acid bị diazo hóa + H2O 14 KIỂM TRA KHỬ... – chất chỉ thị pH Phản ứng: Citrate oxalacetate + acetate Oxalacetate pH kiềm pH acid Pyruvate 2 pyruvate 2 pyruvate Pyruvate + CO2 acetate + formate acetate + CO2 + lactate acetoin + 2CO2 9 CITRATE TEST 9.4 Cơ sở sinh hóa: Môi trường có chứa muối ammonium vô cơ Vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn Carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium làm nguồn Nitơ và sinh NH3 làm môi trường... agar) 5.3 Phản ứng: H2N C=O + 2 HOH Urease CO2 + H2O+2NH3 ↔ (NH4)2CO3 H2N Urea Phenol red 5.4 Đọc kết quả – Dương tính: môi trường có màu hồng – Âm tính: môi trường không đổi màu (vàng cam) 6 METHYL RED (MR) TEST 6.1 Nguyên tắc: kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo ra từ quá trình lên men glucose của vi sinh vật 6.2 Môi trường: MR-VP Broth 6.3 Thuốc thử: chỉ thị pH Methyl 6.4 Phản ứng: (-)... khuẩn lạc 12 STRING TEST Giống như phản ứng nhuộm gram, string test dựa trên sự khác nhau về cấu trúc hóa học của vách tế bào Vách tế bào của vi khuẩn gram âm dễ vỡ khi tiếp xúc với dung dịch kiềm String test bước đầu có thể phân loại được vi khuẩn gram âm và gram dương String test dương tính Màng tế bào 13 KIỂM TRA LÀM TAN CHẢY GELATIN 13.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh enzyme gelatinase làm tan