ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *********************** LÊ THỊ THƠM Đề tài: “TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 TỪ SINH KHỐI VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 CỦA VIỆT NAM” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *********************** Lê Thị Thơm Đề tài: “TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 TỪ SINH KHỐI VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 CỦA VIỆT NAM” Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Đặng Diễm Hồng Hà Nội, 2014 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Diễm Hồng, Trưởng Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành biết ơn sự giúp đỡ to lớn và quý báu đó. Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Công nghệ Tảo đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi hoàn chỉnh số liệu trong luận văn này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên cao học Lê Thị Thơm LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên cao học Lê Thị Thơm Luận văn thạc sĩ sinh học Lê Thị Thơm - K16 i MỤC LỤC MỤC LỤC ……………………………………………………………………… … i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT…………………………………… …… iv DANH MỤC BẢNG………………………………………………………….… v DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………… .…vi MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………… 3 1.1. Giới thiệu về PUFA………………………………………………….………3 1.2. Vai trò và ứng dụng của PUFA…………………………… ………… … 4 1.2.1. Vai trò của PUFAs đối với sức khoẻ con ngƣời 4 1.2.2. Vai trò của PUFAs đối với nuôi trồng thủy sản 6 1.3. Nguồn cung cấp PUFA 7 1.3.1. Nguồn gốc từ thực vật 7 1.3.2. Nguồn gốc từ động vật 8 1.3.3. Nguồn gốc từ vi tảo 9 1.4. Các nghiên cứu về PUFA từ vi tảo biển ……………………………….…11 1.4.1. Con đƣờng tổng hợp PUFA trong vi tảo………………………….…11 1.4.2. PUFAs từ các VTB quang tự dƣỡng…………………………… …13 1.4.3. PUFAs từ các vi tảo biển dị dƣỡng………………………….…….…14 1.5. Vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium………………………………… …15 1.5.1. Giới thiệu chung về tảo di dƣỡng Schizochytrium……………….….15 1.5.1.1. Vị trí phân loại 15 1.5.1.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của Schizochytrium mangrovei 15 1.5.1.3. Sản xuất DHA và PUFAs từ vi tảo Schizochytrium khác… …16 1.6. Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết PUFA ………………………………………………………………… … 17 1.6.1. Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo…………………………… 17 1.6.2. Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết FFA từ dầu thô………………………………………….…… …… 19 1.6.3. Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp axit béo tự do……………………………………………………………………………… …19 1.7. Tình hình nghiên cứu PUFA trong nƣớc và trên thế giới…………… 21 Luận văn thạc sĩ sinh học Lê Thị Thơm - K16 ii 1.7.1. Tình hình nghiên cứu PUFA trên thế giới………….…….…………21 1.7.2. Tình hình nghiên cứu PUFA ở Việt Nam………………………… 22 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… ………25 2.1. Vật liệu ……………………………………………………………… … 25 2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy…… ………………………… …25 2.1.2. Hóa chất và thiết bị………………………………………………… 25 2.2. Phƣơng pháp………………………………………………………… … 26 2.2.1.Tách chiết lipit 26 2.2.2. Tối ƣu các thông số của quá trình tách chiết lipit……….………….27 2.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết FFA từ dầu thô ……………….… 27 2.2.3.1. Tối ƣu nồng độ NaOH trong phản ứng thủy phân dầu thô… 27 2.2.3.2. Nghiên cứu làm giàu hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo omega- 3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA bằng phƣơng pháp tạo phức với urê…… 28 2.2.4. Xác định chỉ số axit của hỗn hợp FFA và hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6……………………………………………………………………… 29 2.2.5. Xác định chỉ số peroxyt của hỗn hợp FFA và hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6…………………………………… ……………………….30 2.2.6. Phƣơng pháp xác định thành phần axit béo……………………… 30 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………….32 3.1. Thành phần và hàm lƣợng axít béo trong sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 nuôi cấy ở bình lên men 30 lít………………………………………… ….32 3.2. Ảnh hƣởng của các tác nhân khác nhau lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối chủng PQ6…………………………………………………………… 33 3.2.1. Ảnh hƣởng của một số yếu tố khác nhau đến quá trình tách chiết lipit……………………………… …………………………………………… 34 3.2.1.1. Ảnh hƣởng của dung môi tách chiết………………………… 34 3.2.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ…………………………………… … 34 3.2.1.3. Ảnh hƣởng của thời gian khuấy……………………………… 36 3.2.1.4. Ảnh hƣởng của chế độ khuấy…………………….…………… 36 3.2.1.5. Ảnh hƣởng của tỉ lệ dung môi và sinh khối…………………….36 3.2.1.6. Ảnh hƣởng của số lần trích ly…………………………… ……37 3.2.1.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy sinh khối………………………….37 3.2.1.8. Ảnh hƣởng của độ ẩm sinh khối……………………………… 38 3.2.2. Thành phần và hàm lƣợng axít béo có trong lipit tổng số …… ….40 3.3. Tối ƣu điều kiện thủy phân dầu thô tảo bằng phƣơng pháp hóa học….41 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ NaOH trong phản ứng xà phòng hóa………………………………………………………….…………… 41 3.3.2. Các tính chất của hỗn hợp axit béo tự do………… …………… 42 Luận văn thạc sĩ sinh học Lê Thị Thơm - K16 iii 3.3.3. Thành phần axit béo của hỗn hợp axit béo tự do thu đƣợc sau phản ứng thủy phân dầu tảo thô…………………………………… …………… …43 3.4. Tối ƣu quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA……………………………………………………………………… …46 3.4.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp FFA: urê lên hiệu suất tạo phức à hiệu suất tách PUFAs………………………………………………………………… 46 3.4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ urê:cồn lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs…………………………………………………………………………………… 47 3.4.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs……………………………………………………………………… 48 3.5. Thành phần axít béo của hỗn hợp axit béo omega 3 và omega 6 thu đƣợc từ dầu thô của chủng PQ6………………………………………… ……………49 3.6. Bƣớc đầu kiểm tra chất lƣợng của dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 thu đƣợc sau quá trình làm giàu………………………….… … ….51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………….…………………… 55 KẾT LUẬN……………………………………………………………………… 55 KIẾN NGHỊ……………………………………………………….………………56 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………….….57 Luận văn thạc sĩ sinh học Lê Thị Thơm - K16 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Từ viết tắt Viết đầy đủ 1 EPA Eicosapentaenoic axít 2 DHA Docosahexaenoic axít 3 DPA Docosapentaenoic axít 4 ALA α-linolenic axít 5 ARA Arachidonic axít 6 AGL Gama linoleic axít 7 DGLA Dihomo-gamma-linoleic axít 8 VTB Vi tảo biển 9 NTTS Nuôi trồng thủy sản 10 SKK Sinh khối khô 11 TFA Total fatty acids (axit béo tổng số) 12 FFA Free fatty acids (axit béo tự do) 13 PUFA Polyunsaturated fatty acid (axit béo không bão hòa đa nối đôi) 14 SFA Saturated fatty acid (axit béo bão hòa) 15 MUFA Monounsaturated fatty acids (axit béo không bão hòa một nối đôi) 16 TAG Triacylglycerol 17 VSV Vi sinh vật 18 PCBs Polychlorinated biphenyls 19 HPLC High-pressure liquid chromatography (sắc khí lỏng cao áp) 20 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam Luận văn thạc sĩ sinh học v Lê Thị Thơm - K16 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo omega-3 và omega-6 có trong một số loại dầu thực vật 8 Bảng 1.2 Hàm lượng DHA và EPA của một số loại cá 9 Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi tảo 11 Bảng 1.4 Sinh khối, lipit và hàm lượng DHA trong thraustochytrids khác nhau 17 Bảng 3.1 Thành phần axit béo của SKK chủng PQ6 33 Bảng 3.2 Thành phần axit béo của lipit tách chiết được từ sinh khối chủng PQ6 40 Bảng 3.3 Một số tính chất của dầu tảo sau phản ứng thủy phân bằng phương pháp hóa học 43 Bảng 3.4 Thành phần axit béo của hỗn hợp FFA thu nhận được sau phản ứng thủy phân dầu tảo thô 44 Bảng 3.5 Thành phần axít béo của hỗn hợp axit béo omega 3 và omega 6 thu được sau quá trình làm giàu 50 Bảng 3.6 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 thu được sau quá trình làm giàu 51 Luận văn thạc sĩ sinh học vi Lê Thị Thơm - K16 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Quá trình tổng hợp PUFA (-3 và -6) trong cơ thể 5 Hình 1.2 Sơ đồ tách chiết PUFA từ vi tảo và lợi ích của nó đối với con người 10 Hình 1.3 Con đường tổng hợp PUFA trong vi tảo Thraustochytrids và Coccolithophores 12 Hình 2.1 Ảnh tế bào tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 và nuôi cấy trong các hệ thống lên men 30 lít 25 Hình 3.1 Ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến hiệu suất tách chiết lipit từ SKK chủng PQ6 35 Hình 3.2 Quy trình tách lipit của chủng PQ6 đạt hiệu suất 70% SKK 39 Hình 3.3 Ảnh minh họa quá trình tách lipit từ SKK chủng PQ6 đạt hiệu suất 70% SKK 39 Hình 3.4 Sắc ký đồ thành phần axit béo của lipit tách chiết từ SKK chủng PQ6 40 Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH lên hiệu suất thủy phân dầu tảo thô 42 Hình 3.6 Sắc ký đồ axít béo có trong hỗn hợp FFA sau phản ứng thủy phân dầu tảo thô thu được từ sinh khối chủng PQ6 44 Hình 3.7 Quá trình thích hợp cho thủy phân dầu tảo thô trong điều kiện phòng thí nghiệm 45 Hình 3.8 Ảnh minh họa quá trình thủy phân dầu tảo thô ở qui mô trong phòng thí nghiệm 46 Hình 3.9 Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các tỷ lệ FFA: urea khác nhau 47 Hình 3.10 Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các tỷ lệ urea: cồn khác nhau 48 Hình 3.11 Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các nhiệt độ kết tinh 49 [...]... cứu Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ sinh khối vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Vi t Nam Trong nghiên cứu này chúng tôi bước đầu tìm ra các điều kiện thích hợp (hệ dung môi, thời gian, chế độ khuấy, nhiệt độ phản ứng, nồng độ và tỉ lệ của các chất tham gia phản ứng…) cho từng giai đoạn của quá trình tách chiết và làm giàu axit béo omega-3. .. và động vật nuôi Mục đích của đề tài nghiên cứu của chúng tôi như sau: +/ Tìm ra qui trình tối ưu cho tách chiết lipit tổng số từ sinh khối tảo dị dưỡng S mangrovei PQ6 +/ Tìm ra qui trình tối ưu cho tách chiết FFA từ lipit tổng số (dầu thô) được tách chiết từ sinh khối tảo dị dưỡng S mangrovei PQ6 +/ Tìm ra được điều kiện thích hợp cho quá trình làm giàu axit béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 và. .. được dầu sinh học giàu omega-3 và omega-6 từ VTB có 3 giai đoạn cần phải tiến hành nghiên cứu như: tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo; tách chiết axit béo tự do (Free fatty acids -FFA) từ dầu thô; tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA sao cho có hiệu xuất cao, đơn giản và dễ thực hiện và có giá thành thấp trong điều kiện phòng thí nghiệm của Vi t Nam Do vậy,... mới mẻ và mới bắt đầu được tiến hành nghiên cứu từ năm 2013 Chính vì vậy, chúng tôi mong muốn thực hiện đề tài nghiên cứu Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ sinh khối VTB dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Vi t Nam với hi vọng kết quả thu được sẽ bước đầu cung cấp những cơ sở khoa học cho phép ứng dụng sản xuất dầu sinh học giàu omega–3 và omega–6 làm thực... tiến hành như: tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo; tách chiết FFA từ dầu thô; tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA Do đó, để thu được hiệu suất tách chiết dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 cao thì hiệu suất tách chiết ở mỗi giai đoạn trên phải hiệu quả cao Chính vì vậy, các yếu tố ảnh hưởng đến từng giai đoạn cũng chính là các yếu tố ảnh hưởng... omega-3 và omega-6 Các kết quả nghiên cứu của đề tài nêu trên là một phần trong hướng nghiên cứu của đề tài: ―Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dƣỡng” của Bộ Công Thương thuộc Đề án Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến cho đến năm 2020 cho Phòng Công nghệ Tảo, Vi n Công nghệ sinh. .. và omega-6 ở quy mô phòng thí nghiệm +/ Đánh giá chất lượng của lipit, FFA thu được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo giàu omega–3 và omega–6, đồng thời đánh giá chất lượng của dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ SKK tảo S mangrovei PQ6 để có thể làm nguyên liệu cho vi c sản xuất vi n thực phẩm chức năng cho người 23 Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh. .. phương pháp này vẫn đạt yêu cầu của thực tế sản xuất [47] 1.6.3 Các phƣơng pháp tách chiết và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp axit béo tự do Công đoạn làm giàu hỗn hợp các axít béo omega-3 và omega-6 nhằm tạo sản phẩm có độ tinh khiết cao Hiện tại, công đoạn này được tiến hành theo nhiều phương pháp khác nhau như: tách phân đoạn bằng li tâm... giảm ô nhiễm, và giảm các chi phí liên quan đến vi c sản xuất sinh khối và thu hoạch 1.4.3 PUFAs từ các vi tảo biển dị dƣỡng Một số VTB dị dưỡng được coi là nguồn cung cấp DHA rất tốt Chúng bao gồm thraustochytrids từ các chi Thraustochytrium Sparrow và Schizochytrium Goldstein và Belsky, và tảo Crypthecodinium cohnii Javornicky Các loài này đại diện cung cấp các loại dầu giàu DHA ưu vi t nhất cho...Luận văn thạc sĩ sinh học khác nhau Sắc ký đồ của hỗn hợp axit béo omega -3 và omega -6 thu được sau quá trình làm giàu 50 Hình 3.13 Quá trình tối ưu làm giàu hỗn hợp axít béo từ FFA 53 Hình 3.14 Ảnh minh họa quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 từ FFA 54 Hình 3.12 vii Lê Thị Thơm - K16 Luận văn thạc sĩ sinh học MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển mạnh mẽ về . Đề tài: “TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 TỪ SINH KHỐI VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 CỦA VI T NAM Chuyên ngành: Hóa sinh thực. trong điều kiện phòng thí nghiệm của Vi t Nam. Do vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ sinh khối vi tảo biển. VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *********************** LÊ THỊ THƠM Đề tài: “TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 TỪ SINH KHỐI VI TẢO