ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ  BÀI TIỂU LUẬN MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ Đề tài KIỂM SOÁT VÀ BIẾN ĐỔI SAU PHIÊN MÃ Ở EUCARYOT Gỉang viên hướng dẫn: Học viên thực hiện: PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc Phạm Thị Hồng Hạnh Lớp: LL&PPGD Sinh học K22 Huế, 2014 Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo – PGS.TS Nguyễn Bá Lộc đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin chận thành cảm ơn các anh, chị và các bạn ở lớp sinh khóa 22 đã luôn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC  !"#$%&'( )*)+,!'%-./!012% 3$456'7890:: 5&'()*)+,!': ;: <=>=>? @ABBCDBEFG :HIJ770'- G :HHI+ #2 5-*0KL)&%MNOFPQ0'RSPG :H:T#Q0'5SU463V%WQ0'RSPN :H?T3V%WQ0SPX :HGSP0YZ7[7[\ :HN.,7R0SPZ]PS[#Y]^ ::K_70'- ` ::HK_'RSP)K3[80)` ::X>L)&Q0'RSP:: @AaCbBBcF@S<I@de:N PHẦN I: MỞ ĐẦU Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối liên hệ giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối quan hệ này. Như ta đã biết một gen được xem là hoạt động khi thông tin đó được sử dụng để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein hay phân tử ARN. Điều đáng ghi nhớ là thông tin chỉ được phiên mã và dịch mã theo một chiều từ ADN sang ARN đến protein. Không xảy ra hiện tượng thông tin truyền từ ADN sang thẳng protein hoặc từ protein ngược trở lại acid nucleic. Việc trao đổi thông tin giữa các dạng acid nucleic (giữa ADN và ARN) có thể xảy ra thuận nghịch. Ví dụ, ADN → ARN (phiên mã xuôi từ ADN sang ARN), ARN → ADN (phiên mã ngược từ ARN sang ADN – reverse transcription), ADN → ADN (tái bản ADN), ARN → ARN (nhân bản ARN bởi ARN polymerase dựa trên khuôn ARN). Một trong những quá trình quan trọng đó là sự phiên mã. Phiên mã ở sinh vật nhân sơ khác với sinh vật nhận chuẩn đó là ở sinh vật nhân chuẩn, ARN polymerase kết hợp với một số enzyme tham gia vào quá trình chế biến ARN thông tin, điều này cho phép quá trình chế biến ARN thông tin có thể diễn ra ngay khi khởi đầu sự phiên mã. Phân tử ARN thông tin mới đầu được tạo thành có tuổi thọ ngắn, chưa được hoặc chỉ mới xử lý một phần được gọi là tiền ARN thông tin (pre-mRNA) đến khi hoàn thành quá trình chế biến thì gọi là ARN thông tin trưởng thành. Để tìm hiểu rõ hơn về quá trình sửa đổi ARN sau quá trình phiên mã tôi đã chọn đề tài: “ KIỂM SOÁT VÀ BIẾN ĐỔI SAU PHIÊN MÃ Ở EUCARYOT ” PHẦN II: NỘI DUNG 2.1. Kiểm soát sau phiên mã 2.1.1 Kìm hãm dịch mã liên quan đến cấu trúc vùng 5'UTR của phân tử ARNm Phân tử ARNm có các vùng 5' không dịch mã (5’ UTR – 5’ Untranslated Region) nằm phía trước mã khởi động (AUG) và vùng 3’ không dịch mã (3’ UTR) nằm sau mã dừng. Đầu 5' không dịch mã có thể tạo cấu trúc cặp tóc ngăn cản ribosome khởi động dịch mã. Ngoài ra, phần 5’ UTR có thể là vị trí tương tác của một số protein repressor. Khi đó ribosome không thể dịch chuyển trên sợi ARNm khiến cho quá trình dịch mã bị kìm hãm hoàn toàn. Rõ ràng trong trường hợp này, ARNm vẫn được tổng hợp một cách bình thường nhưng protein không được tạo ra. Cơ chế điều khiển quá trình dịch mã do protein tương tác với đầu 5' của ARNm được gọi là "kiểm soát dịch mã tiêu cực" (negative translational control). Ở tế bào eukaryot, kiểm soát dịch mã tiêu cực được phát hiện đối với phản ứng tổng hợp ferritin - protein làm nhiệm vụ tạo phức với các nguyên tử sắt. Khi môi trường không có sắt, các phân tử ARNm ferritin bị aconitase (protein repressor) bám vào đầu 5', do đó không có protein ferritin được tổng hợp trong tế bào. Khi có sắt trong môi truờng, aconitase liên kết với sắt và rời khỏi ARNm ferritin. Lúc này ferritin được tổng hợp với số lượng lớn gấp 100 lần so với lúc ban đầu. 2.1.2 Độ dài của đuôi polyA ảnh hưởng tới độ bền vững của phân tử ARNm Hình 1: Độ dài đuôi polyA ảnh hưởng đến độ bền vững và quá trình dịch mã trên phân tử ARNm. Đuôi polyA có thể được thêm vào hoặc cắt ngắn đi, nhưng độ dài của nó không được ít hơn 30 nucleotide A. 2.1.3 Độ bền vững của ARNm Trong tế bào vi khuẩn, các phân tử ARNm thường bị phân hủy rất nhanh. Thời gian bán hủy của chúng thay đổi từ 3-5 phút ngay khi có hoặc không có các chất cảm ứng trong môi trường. Do đó khi tế bào vi khuẩn mọc và phân chia trong khoảng thời gian 20-30 phút, các ARNm cần được tái tạo mới 5-10 lần trong mỗi lần phân chia. Khi tế bào yêu cầu một số enzym, ARNm cần thiết để tổng hợp các enzym đó được phiên mã nhanh chóng. Khi tế bào không còn nhu cầu, quá trình phiên mã dừng rất nhanh và các phân tử ARNm lập tức bị phân hủy. Enzym nuclease chịu trách nhiệm phân hủy ARNm đến nay vẫn chưa được xác định rõ ràng. Đối với một số ARNm polycistronic của các operon như lac hoặc trp, chúng bị phân cắt bởi endonuclease tạo ra các monocistronic tương ứng với từng gen trong operon. Khoảng cách giữa các monocistronic không chứa mã di truyền, do đó không được che chắn bởi ribosome nên chúng dễ bị cắt bởi endonuclease. Các ARNm prokaryot được tổng hợp cũng như bị phân hủy rất nhanh, do đó vi khuẩn có thể thích ứng nhanh nhạy với những thay đổi của môi trường. Ngược lại, các ARNm eukaryote khá bền vững. Ví dụ ARNm mã cho β-globin có thời gian bán hủy khoảng hơn 10h. Tuy nhiên cũng có những loại ARNm có thời gian bán hủy chỉ 30 phút hoặc ít hơn. Thường đó là những ARNm mã cho các protein làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen. Các phân tử ARNm eukaryot kém bền do chúng mang các đoạn nucleotide đặc biệt tại đầu 3' kích thích sự phân hủy ARNm. Thực nghiệm cho thấy khi đoạn nucleotide giàu A và U ở vùng 3' không dịch mã của phân tử ARNm kém bền được ghép vào một số ARNm bền vững khác, thì những phân tử này trở nên kém bền do đuôi polyA bị cắt ngắn nhanh. Như vậy đoạn nucleotide giàu AU kích thích sự phân hủy ARNm thông qua việc giảm độ dài đuôi polyA. Ngoài ra, một số ARNm có chứa vị trí đặc hiệu ở đầu 3' được nhận biết bởi endonuclease. 2.1.4 ARN anti-sense Thông thường, các protein giữ vai trò chủ đạo kiểm soát quá trình phiên mã cũng như dịch mã. Tuy nhiên hoạt động của một số gen lại được điều khiển bởi các ARNs. Cũng giống như các protein điều khiển, các ARNs làm nhiệm vụ kiểm soát hoạt động của gen được tổng hợp một cách độc lập và tương tác với các vị trí đặc hiệu (các đoạn nucleotide). Xét trường hợp cụ thể về vai trò điều khiển sau phiên mã của ARNs đối với việc tổng hợp protein OmpF ở tế bào vi khuẩn E.coli. Protein OmpF nằm phía ngoài màng tế bào làm nhiệm vụ nhận biết những thay đổi về áp suất thẩm thấu trong môi trường. Khi áp suất tăng thì gen điều khiển micF hoạt động mạnh hơn. Sản phẩm của gen micF là phân tử ARN 174 bases, có thể tạo cặp theo nguyên tắc bổ sung với vị trí nhận biết của ribosome trên phân tử ARNm của gen ompF. Như vậy phân tử ARNm của micF làm nhiệm vụ ngăn cản việc tổng hợp protein OmpF. Các phân tử ARN có chức năng tương tự micF được gọi là ARN-antisense (Hình 2). Hình 2: Phân tử ARN-antisense-micF kiểm soát dịch mã của phân tử ARNm -ompF. Phân tử đúp ARN/ARN tạo thành khiến ribosome không tổng hợp được protein OmpF. 2.1.5 Phản ứng đọc sửa ARNm - "RNA editing" Phản ứng đọc sửa ARNm làm thay đổi trình tự nucleotide của phân tử ARNm. Phản ứng này xảy ra trong tế bào chất. Các nucleotide của một số phân tử ARNm bị loại bỏ hoặc bị thay thế, một số nucleotide khác được thêm vào. Như vậy trình tự nucleotide trên phân tử ARNm khác với gen (ADN) mà từ đó phân tử ARNm được phiên mã. Phản ứng này được phát hiện đầu tiên đối với ARNm mã hóa cho protein ở ty thể của trypanosome. Các phân tử ARNm này mang thêm một vài nucleotide U khác với trình tự trên gen ADN. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy phân tử ARNm trong ty thể của tế bào thực vật hầu như đều trải qua phản ứng "RNA editing". Tuy nhiên đối với các ARNm này, chỉ có sự thay thế nucleotide C bằng U mà không có hiện tượng thêm vào hoặc loại bỏ các nucleotide khác. Trình tự các acid amin ở protein có thể thay đổi đến 10% hoặc hơn nữa so với protein được mã bởi phân tử ARNm chưa trải qua phản ứng này. Hình 3: Thay đổi thông tin di truyền trên phân tử ARNm của gen apo-B bởi cơ chế "ARN editing". Chiều dài phân tử ARNm không đổi nhưng nucleotide U thay thế C tạo ra một mã dừng tổng hợp protein. Ở động vật, các phân tử ARNm ít trải qua phản ứng "RNA editing". Trường hợp đầu tiên được phát hiện đối với gen apolipoprotein B (apo-B) dài 4503 bp, là gen đơn bản trong genome người (Hình 2.16). Từ gen này hai loại phân tử ARNm được tổng hợp. Chúng chỉ khác nhau bởi một nucleotide C bị thay thế bởi U. Do đó làm xuất hiện một mã dừng phản ứng tổng hợp protein. Protein ngắn tương ứng với loại ARNm này có trọng lượng phân tử 250 KDal và chỉ tồn tại ở trong ruột. Phân tử protein 512 KDal tương ứng với ARNm không bị đọc sửa tồn tại ở cả gan và ruột. Phản ứng "RNA editing" được thực hiện nhờ các phân tử ARN dài khoảng 40 - 80 base. Các ARN này gọi là ARN phụ trợ, ký hiệu là ARNg (guide RNA). Chúng được tổng hợp độc lập với nhau. Đầu 5' của chúng có thể tạo liên kết với ARNm cần sửa đổi, còn đầu 3' mang đuôi polyU. Các nucleotide U được chuyển trực tiếp từ đuôi này sang ARNm. Quá trình đọc sửa diễn ra từ đầu 3' và tiếp tục về đầu 5' của ARNm. Có thể có nhiều ARNg tham gia sửa đổi một phân tử ARNm. 2.2. Biến đổi sau phiên mã 2.2.1 Biến đổi phân tử ARNm trong tế bào eukaryot Trong tế bào eukaryot, quá trình phiên mã phụ thuộc vào từng loại promoter cũng như từng loại enzym ARN polymerase. Các ARNr được tổng hợp nhờ ARN polymerase I, ARNm được tổng hợp bởi ARN polymerase II và các ARNt và 5S ARNr được phiên mã nhờ ARN polymerase III. Promoter cho các ARN polymerase I và II thường nằm trước vùng chứa mã di truyền trong khi một số promoter cho ARN polymerase III nằm phía sau điểm bắt đầu phiên mã (tức là promoter của ARN polymerase III nằm ngay trong vùng chứa mã di truyền). Cùng với các ARN polymerase, phản ứng tổng hợp ARN trong tế bào eukaryot chỉ thực hiện được khi có sự tham gia của nhiều protein khác. Chúng tạo thuận lợi để enzym khởi động phiên mã tại promoter của các gen eukaryot. Đây là điều khác biệt giữa quá trình phiên mã ở tế bào prokaryot và eukaryot. Promoter ở prokaryot thường kìm hãm bởi protein ức chế, vì thế chúng được xem là promoter mạnh. Ngược lại, promoter ở eukaryot thường đòi hỏi phải có các protein hoạt hoá; chúng được xem là promoter yếu. Hình 4: Kỹ thuật xác định vị trí +1 sử dụng S1 nuclease. Đoạn ADN chứa vị trí +1 được lai với phân tử ARNm. Phân tử lai dạng kép này được xử lý với S1 nuclease để phân hủy phần nucleotide không lai. Sau đó, phân tử lai được điện di cùng với mẫu xác định trình tự của đoạn ADN ban đầu. Trên Hình 4 cho thấy nucleotide A chính là vị trí đầu tiên được phiên mã sang phân tử ARNm. Để xác định vị trí +1, tức là nucleotide đầu tiên được phiên mã sang phân tử ARNm, chúng ta có thể áp dụng kỹ thuật "S1 nuclease mapping" (xác định vị trí +1 bởi S1 nuclease). Đầu tiên, đoạn ADN (sàng lọc từ genome) có chứa phần 5' của gen được lai với ARNm của chính gen đó. Tiếp theo, phần nucleotide ADN hoặc ARNm không lai với nhau mà ở dạng sợi đơn sẽ bị phân hủy bởi S1 nuclease. Chỉ có phân tử lai dạng kép được điện di trên gel acrylamide cùng với phản ứng xác định trình tự của chính đoạn ADN ban đầu. Nhờ đó, vị trí nucleotide đầu tiên +1 được xác định chính xác (Hình 4). Quá trình tổng hợp ARNm eukaryot xảy ra nhờ ARN polymerase II. Tuy nhiên enzyme này không tự bắt đầu phản ứng mà đòi hỏi sự phối hợp của nhiều yếu tố phiên mã. Nhờ tương tác với ARN polymerase II hoặc với ADN ở promoter hay ở các vị trí khác ngoài promoter, các yếu tố này giúp enzym nhận biết dễ dàng các vị trí bảo toàn trên promoter để bắt đầu quá trình phiên mã. Cho đến nay vị trí dừng chính [...]... trình cơ bản của sinh học phân tử, 2007, NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2 PGS TS Nguyễn Hoàng Lộc (chủ biên) , Giáo trình Sinh học phân tử ,2007 Nxb Đại học Huế 3 Đỗ Lê Thăng-Đinh Đoàn Long, Chú giải di truyền học, 2007, Nxb giáo dục 4 Lê Duy Thành, Di truyền học, 2007, Nxb khoa học & kỹ thuật 5 Lê Duy Thành (chủ biên), Cơ sở sinh học phân tử, 2009, Nxb Giáo Dục 6 Lê Đức Trình, Sinh học phân tử của tế bào,... một số ARNm có các vị trí nhận biết bởi endonuclease hoặc chứa các đoạn nucleotide đặc biệt (giàu AU) kích thích sự phân hủy ARNm Hình 13: Quá trình phiên mã và dịch mã Gen chứa các exon (E) và các intron (I) được phiên mã sang phân tử ARNm tiền thân Quá trình biến đổi ARNm thành phân tử hoàn hỉnh để sử dụng làm khuôn dịch mã trong quá trình tổng hợp protein Phân tử ARNm eukaryot khá bền vững Thời gian... được phiên mã từ các gen của mẹ và được dự trữ trong tế bào trứng Chúng thường có đuôi polyA rất ngắn (10-30 A) nên không được dịch mã Chỉ sau khi trứng thụ tinh, các ARNm này được thêm đuôi polyA và trở thành khuôn để tổng hợp protein PHẦN III KẾT LUẬN Sự phiên mã là sự tổng hợp ARNm từ khuôn AND Sự phiên mã ở eucaryot theo những giai đoạn tương tự như với procaryot, nhưng phức tạp hơn do bộ gen của eucaryot. .. polyA vào đầu 3', gắn "mũ" Gm7 vào đầu 5' (ở vị trí 2' của đường ribose) và cắt nối intronexon thành phân tử ARNm hoàn chỉnh Phản ứng methyl hoá tạo cấu trúc mũ giúp cho ribosome nhận biết được phân tử ARNm và bám vào nó Cấu trúc mũ còn giúp bảo vệ đầu 5’ của ARNm không bị phân cắt bởi exonuclease Hình 5: Phối hợp giữa vị trí polyA (AATAAA) và phức protein trong quá trình tổng hợp ARNm Phức CPSF và CstF... mRNA hoàn chỉnh, các intron được cắt bỏ và các exon nối lại với nhau Đối với các đơn vị phiên mã ngắn, quá trình nối RNA thường xảy ra sau sự phân cắt và polyadenyl hoá đầu 3’ của các bản sao phiên mã sơ cấp, như mô tả ở hình 10 Tuy nhiên, đối với các đơn vị phiên mã dài chứa nhiều exon, quá trình nối exon trong các mRNA mới sinh thường bắt đầu trước khi sự phiên mã các gen hoàn thành Hình 10 Các nghiên... đầu 5', đuôi polyA ở đầu 3' Phân tử ARNm có chứa vùng 5' không dịch mã (5’ UTR) và vùng 3' không dịch mã (3’UTR) Phần 5’UTR nằm trước mã bắt đầu tổng hợp peptide"start codon" còn phần 3’UTR nằm sau mã dừng tổng hợp protein "stop codon" (Hình10) Các vùng này liên quan đến kiểm soát tính bền vững của ARNm cũng như kiểm soát quá trình dịch mã trên sợi ARNm Vùng 5' không dịch mã thường chứa các đoạn oligonucleotide... như khả năng dùng làm khuôn dịch mã phụ thuộc phần nào vào độ dài đuôi polyA Trong thực tế, không phát hiện được phân tử ARNm có đuôi polyA ngắn hơn 30A Độ dài của đuôi liên quan đến tính bền vững của ARNm nên việc thêm hoặc bớt các nucleotide A vào đuôi được kiểm soát rất chặt chẽ (cần lưu ý đuôi polyA được gắn vào ARNm ngay sau khi phiên mã ở trong nhân Tuy nhiên thay đổi độ dài của đuôi có thể xảy... ảnh hưởng đến phản ứng này Đặc biệt trong cấu trúc của mỗi intron, hai nucleotide đầu tiên GU ở đầu 5' và hai nucleotide AG tận cùng ở đầu 3' giữ vai trò quyết định Chúng được bảo toàn ở mọi intron và là vị trí nhận biết để cắt intron ra khỏi phân tử tiền thân ARNm 2.2.2 Gắn mũ Hình 6 Cấu trúc tổng quan của mRNA ở eukaryote Các ARN thông tin của sinh vật nhân thật và virus có một cấu trúc đặc biệt ở hai... (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor) và protein CstF (Cleavage Stimulation Factor) Phần COOH của tiểu đơn vị lớn nhất của ARN polymerase II cần thiết cho việc thêm đuôi polyA Do đó, việc kết thúc phiên mã và thêm đuôi có thể xảy ra đồng thời trong nhân tế bào eukaryot (Hình 5) Sau khi được phiên mã, phân tử tiền thân ARNm eukaryot phải trải qua ba thay đổi cơ bản trước khi được dùng làm khuôn để... trong tế bào chất cần thiết trong quá trình dịch mã Cấu tạo "mũ" chụp ở đầu 5' của mRNA 2.2.3 Thêm đuôi poly A Đầu còn lại sẽ bị tách bởi một enzyme phân hóa (endonuclease) để giải phóng nhóm hydroxyl ở 3' của nucleotide đầu cuối 3' và thêm vào adenylic acid nhờ vào enzyme poly (A) polymerase Quá trình này liên quan mật thiết với việc kết thúc phiên mã, và một lần nữa, có sự tham gia của ARN polymerase . ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ  BÀI TIỂU LUẬN MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ Đề tài KIỂM SOÁT VÀ BIẾN ĐỔI SAU PHIÊN MÃ Ở EUCARYOT Gỉang viên hướng dẫn: Học viên thực hiện: PGS.TS trình chế biến thì gọi là ARN thông tin trưởng thành. Để tìm hiểu rõ hơn về quá trình sửa đổi ARN sau quá trình phiên mã tôi đã chọn đề tài: “ KIỂM SOÁT VÀ BIẾN ĐỔI SAU PHIÊN MÃ Ở EUCARYOT ” PHẦN. ` ::HK_'RSP)K3[80)` ::X>L)&Q0'RSP:: @AaCbBBcF@S<I@de:N PHẦN I: MỞ ĐẦU Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối liên hệ giữa