BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ PHA ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG ĐẤT VÙNG RỄ LÚA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO CHO CANH TÁC LÚA LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ PHA ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG ĐẤT VÙNG RỄ LÚA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO CHO CANH TÁC LÚA LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC M ngnh: 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP 2014 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp, người đã tận tình hướng dẫn khoa học, tư vấn thiết kế các thí nghiệm, hướng dẫn cách tiếp cận các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, từ đó giúp tôi hoàn thành luận án nghiên cứu sinh. Xin chân thành cảm ơn và tri ân sâu sắc đến thầy. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa Học, Khoa Sau Đại Học và các phòng ban chức năng khác của trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi trong thực hiện các thủ tục, h trợ kinh phí, trang thiết bị máy móc,…cho các nghiên cứu của luận án. Chân thành cảm ơn quý thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu. Xin cảm ơn anh Bùi Xuân Kỹ, Ông Phan Hoàng Nhiệm, anh Hứa Lập Điền đã h trợ đất ruộng để triển khai thực hiện các thí nghiệm ngoài đồng. Chân thành cảm ơn các em sinh viên thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã cộng tác trong thời gian thực hiện luận án. Sau cùng xin được cảm ơn cha mẹ, những người thân trong gia đình, chồng và hai con đã hết lòng động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! NGUYỄN THỊ PHA TÓM TẮT Sản xuất lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chủ yếu sử dụng phân bón hóa học làm tăng giá thành sản phẩm và ảnh hưởng xấu đến độ phì của đất. Ứng dụng vi khuẩn cố định đạm trên ruộng lúa là giải pháp hữu hiệu cải thiện ii vấn đề này. Đề tài luận án “Đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa” đã được thực hiện từ tháng 6/2010 đến tháng 3/2014, nhằm mục tiêu i) Phân lập được tập đoàn vi khuẩn cố định đạm ở vùng đất quanh rễ lúa trồng trên 3 loại đất chnh ở các tnh ĐBSCL (đất phù sa, đất phn và đất mn); ii) Khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định đạm thông qua vùng gen 16S rDNA; và iii) Tuyển chọn được 2- 3 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu, phù hợp với lúa trồng ở từng vùng sinh thái khác nhau. Tập đoàn vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa các tnh ĐBSCL trên 3 loại đất được phân lập trên môi trường Burk không đạm, sau đó nhân sinh khối và xác định hàm lượng NH 4 + bằng phương pháp Indophenol Blue. Một trăm hai mươi dòng vi khuẩn có hàm lượng đạm cao được khảo sát đa dạng di truyền thông qua vùng gen 16S rDNA bằng cp mồi tổng 27F và 1495R kết hợp với enzyme cắt giới hạn HaeIII. Hai mươi dòng vi khuẩn có hàm lượng đạm cao nhất cho mi vùng sinh thái được sử dụng để tuyển chọn các dòng tốt nhất qua khả năng cung cấp đạm cho cây lúa trong môi trường Yoshida không đạm, trong chậu ở điều kiện nhà lưới và đưa ra ngoài đồng ruộng. Ba trăm tám mươi dòng vi khuẩn đã được phân lập, tất cả đều có khả năng tổng hợp NH 4 + . Các dòng vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc màu trắng trong và trắng đục, một số t có màu vàng và nâu nhạt, độ nổi mô, bìa nguyên, bề mt ướt, hình tròn chiếm ưu thế. Tế bào vi khuẩn có ba dạng là hình que dài (2,5- 3,4 µm), hình que ngắn (1,5-2,4 µm), và hình cầu, trong đó dạng que ngắn chiếm ưu thế. Đa số các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm và đều có khả năng chuyển động. Khảo sát đa dạng di truyền 120 dòng vi khuẩn cho thấy, sự tương đồng về vùng gen 16S rDNA được xác định ở mức 75%. Các dòng vi khuẩn vùng sinh thái đất phù sa có mức tương đồng (80%) cao hơn so với sinh thái đất nhiễm phn (77%) và mn (75%). Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn xác định được 10 dòng vi khuẩn phân lập trên đất phn, 8 dòng vi khuẩn của mi vùng đất phù sa và đất mn, có hàm lượng đạm cố định cao nhất. Bốn dòng vi khuẩn trên mi vùng sinh thái cung cấp đạm tốt nhất cho cây lúa trong môi trường Yoshida không đạm và 2 dòng vi khuẩn của mi vùng sinh thái có khả năng thay thế từ 25-50% phân đạm cho cây lúa trồng trong chậu ở nhà lưới, gồm AM3, TV2B7 (đất mn), TN20, PH27 (đất phn), CT1N2 và CTB3 (đất phù sa). Kết hợp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử với đc tnh sinh lý, sinh hóa, xác định được các dòng vi khuẩn AM3, TV2B7, TN20, PH27, CT1N2 và CTB3 theo thứ tự có quan hệ gần nhất với các loài: Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus megaterium, Burkholderia tropica, Burkholderia sp., iii Ideonella sp. và Serratia marcescens. Ở điều kiện đồng ruộng, 6 dòng vi khuẩn này có thể thay thế 25-50% phân đạm mà vẫn cho năng suất tương đương đối chứng bón đầy đủ đạm. Trong đó dòng vi khuẩn AM3 (Stenotrophomonas maltophilia) ch thay thế được 25% phân đạm. Các dòng còn lại đều thay thế được 50% phân đạm, riêng dòng CTB3 (Serratia marcescens) còn cho năng suất cao hơn đối chứng khi bón 75-100% phân đạm. Từ khóa: cố định đạm sinh học, canh tc la, đa dạng di truyền, enzyme ct gii hạn, vi khuẩn vùng rễ la. iv GENETIC DIVERSITY OF NITROGEN-FIXING BACTERIA GROUP IN THE SOIL OF RICE RHIZOSPHERE IN THE MEKONG DELTA AND SELECTION OF SOME BACTERIA STRAINS WITH HIGH NITROGEN -FIXING CAPABILITY FOR RICE CULTIVATION ABSTRACT Rice production in the Mekong Delta mainly uses chemical fertilizers, which increases the cost of rice production and decreases the soil fertility. Application of nitrogen-fixing bacteria on the rice fields is an effective solution for these problems. Research thesis "Genetic Diversity of nitrogen-fixing bacteria group in the soil of rice rhizosphere in the Mekong Delta and selection of some bacteria strains with high nitrogen-fixing capability for rice cultivation" was carried out from June of 2010 to March of 2014, with the aims of: i) Isolation of nitrogen-fixing bacteria in the rice rhizosphere soil from 3 different categories of land in the Mekong Delta provinces (alluvial soil, alum soil and saline soils); ii) Survey of genetic diversity of nitrogen-fixing bacteria via 16S rDNA region; and iii) Selection of 2-3 bacterial strains with a high nitrogen fixation effectiveness, replacement of as much as possible the chemical nitrogen for growth and grain yield of rice in different ecological areas. Groups of bacteria from rice rhizosphere soil in 3 soil categories of Mekong delta were isolated in the Burk medium without nitrogen supplement. The NH 4 + synthesis of these bacterial strains after biomass multiplication was determined by Indophenol Blue method. One hundred twenty bacterial strains with high NH 4 + synthesis were used to survey genetic diversity through the 16S rDNA gene by the general primers pairs 27F and 1495R, cloven by Endonuclease HaeIII restriction enzymes. Twenty bacterial strains having the highest NH 4 + synthesis for each ecoregion were used to select the best bacteria strains through nitrogen fixing supply for rice plants in Yoshida medium without nitrogen supplement, in net-house conditions, and in the field experiments. Three hundred eighty bacterial strains were isolated from 3 soil categories of Mekong delta. All of them could biosynthesize NH 4 + . In general, almost of isolated bacterial strains had translucent and opalescent colonies, some of them with yellow and light brown colour, convex elevation, margin of colonies was entire, moist texture, and circular shapes were predominant. Bacterial cells had three types of long rods (2.5-3.4µm), short rods (1.5-2.4µm), and spherical shapes, in which the short rod shapes were predominant. Almost of bacterial strains belonged to gram- negative group, and motile. Survey of the genetic diversity of 120 bacteria strains showed that, the similarity of 16S rDNA gene was identified in 75%. The bacterial strains isolated from alluvial soil had higher similarity levels (80%) than those of v the alum soil (77%) and saline soil (75%). Results of nitrogen fixing bacteria selection identified 10 bacterial strains isolated from alum soil and 8 strains of each alluvial soil and saline soil provided the highest NH 4 + compounds. Four bacterial strains on each ecoregion could replace 25-50% nitrogen supplied, consisted of AM3, TV2B7 (saline soil), TN20, PH27 (acid sulfate soils), and CTB3 and CT1N2 (alluvial soil). Based on the results of molecular biology technique and biochemical tests, strains AM3, TV2B7, TN20, PH27, CT1N2 and CTB3 were closest genetic relationship with Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus megaterium, Burkholderia tropica, Burkholderia sp., Ideonella sp. and Serratia marcescens, respectively. In the field condition, these 6 bacterial strains could replace 25-50% chemical nitrogen fertilizer with the equivalent grain yield as positive control (100%N), in which bacterial strain AM3 (Stenotrophomonas maltophilia) could only replace 25% chemical nitrogen fertilizer. The remaining strains could replace up to 50% nitrogen supplied. Especialy, CTB3 bacterial strain (Serratia marcescens) could support higher grain yields with significant difference than positive control when applied 75-100% nitrogen fertilizer. Key words: Biological nitrogen fixation, genetics diversity, restriction enzyme, rhizospheric bacteria, rice cultivation. vi CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án “Đa dạng di truyền tập đon vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa” này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Thị Pha vii MỤC LỤC TÓM TẮT i ABSTRACT iv CHƯƠNG I MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 2 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 3 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3 1.5 Những đóng góp của luận án 4 1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án 4 CHƯƠNG II TỔNG QUAN 6 2.1 Diện tch đất trồng lúa và hiện trạng sử dụng phân bón cho lúa ở ĐBSCL 6 2.1.1 Đc tnh nhóm đất phèn 6 2.1.2 Đc tnh nhóm đất mn 9 2.1.3 Đc tnh nhóm đất phù sa 10 2.2 Hiện trạng sử dụng phân bón cho lúa ở ĐBSCL 12 2.2.1 Phân bón vô cơ 12 2.2.2 Phân bón hữu cơ 13 2.2.3 Phân bón vi sinh 13 2.3 Vai trò của phân đạm đối với cây lúa 16 2.4 Tổng quan về vi khuẩn vùng rễ (ENDORHIZOPHERICS) 17 2.4.1 Sự đa dạng của các chi vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định đạm 18 2.4.2 Bản chất quá trình cố định đạm ở vi sinh vật 22 2.4.3 Hệ thống cố định đạm tự do của vi sinh vật 25 2.5. Tổng quan về đa dạng di truyền vi khuẩn 26 2.5.1 Một số nhân tố ảnh hưởng đến đa dạng di truyền 28 2.5.2 Đa dạng di truyền vi sinh vật 28 2.6 Các phương pháp phân tch đa dạng vi sinh vật 29 CHƯƠNG III NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Nội dung nghiên cứu 33 3.2 Phương tiện nghiên cứu 33 3.2.1 Vật liệu 33 3.2.2 Dụng cụ 34 3.2.3 Thiết bị thí nghiệm 34 viii 3.2.4 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 34 3.3 Phương pháp nghiên cứu 35 3.3.1 Thu mẫu đất vùng rễ lúa 35 3.3.2 Phân lập vi khuẩn 36 3.3.3 Khảo sát hình thái khuẩn lạc và vi khuẩn 37 3.3.4 Kiểm tra hoạt tính cố định đạm của các dòng vi khuẩn 37 3.3.5 Khảo sát đa dạng di truyền vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR- RFLP 40 3.3.6 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao đối với cây lúa ở điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới 42 3.3.7 Định danh các dòng vi khuẩn cho hiệu quả tốt với cây lúa trong điều kiện nhà lưới 49 3.3.8 Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản trồng ở điều kiện ngoài đồng 52 3.3.8.1 Sinh thái đất phù sa 52 3.3.8.2 Sinh thái đất phèn 54 3.3.8.3 Sinh thái đất mn 55 3.4 Tóm tắt các nội dung thí nghiệm 56 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 4.1 Phân lập vi khuẩn cố định đạm vùng rễ lúa tại 06 tnh vùng ĐBSCL 58 4.1.1 Kết quả thu mẫu đất vùng rễ 58 4.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ cố định đạm 58 4.2 Khảo sát khả năng tổng hợp NH 4 + của các dòng vi khuẩn phân lập 61 4.2.1 Sinh thái đất phù sa 61 4.2.1 Sinh thái đất phèn 63 4.2.3 Sinh thái đất nhiễm mn 64 4.3 Khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định đạm thông qua vùng gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR kết hợp enzyme cắt giới hạn 65 4.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa 87 4.4.1 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao đối với cây lúa ở điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới 88 4.4.2 Định danh các dòng vi khuẩn cho hiệu quả tốt với cây lúa trong điều kiện nhà lưới 106 4.4.3 Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn tuyển chọn đối với lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng 116 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 132 5.1 Kết luận 132 [...]... soát) và ngược lại Chính điều này làm cho vi c ứng dụng phân bón sinh học từ các chủng vi khuẩn chưa được áp dụng rộng rãi trong sản xuất vì tính ổn định của các loại phân bón này không cao Đề tài Đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa được tiến hành nhằm cung cấp một. .. Phân lập được tập đoàn vi khuẩn cố định đạm ở vùng đất quanh rễ lúa trồng trên 3 loại đất chính ở các tỉnh ĐBSCL (đất phù sa, đất phèn và đất mặn)  Tìm ra được 2-3 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu phù hợp với lúa trồng ở từng vùng sinh thái khác nhau (đất phù sa, đất phèn và đất mặn) vùng ĐBSCL  Khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định đạm thông qua vùng gen 16S rDNA... vi khuẩn được khảo sát khả năng cung cấp đạm ở điều kiện nhà lưới, và 6 dòng được khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây lúa ở điều kiện ngoài đồng - Bước đầu khảo sát sự đa dạng về vùng gen 16S rDNA của 120 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao đại di n cho mỗi tỉnh thành Kết quả 120 dòng khảo sát có mức tương đồng đạt 75% - Bước đầu định danh và mô tả các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 6 dòng. .. dòng TV2B7 tương đồng với dòng Bacillus megaterium (98%) 1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án * Ý nghĩa khoa học - Phân lập, tuyển chọn và bước đầu định danh được các dòng vi khuẩn vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa ở ba vùng sinh thái khác nhau là đất phù sa, đất nhiễm phèn và đất nhiễm mặn - Xác định được đa dạng di truyền vùng gen 16S rDNA của các dòng vi. .. cứu Phân lập vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa của 6 tỉnh thành thuộc đồng bằng sông Cửu Long đại di n cho ba vùng sinh thái với Thành Phố Cần Thơ và tỉnh Vĩnh Long đại di n cho sinh thái đất phù sa; tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Hậu Giang đại di n cho sinh thái đất nhiễm phèn; tỉnh Trà Vinh và Kiên Giang đại di n cho sinh thái đất nhiễm mặn Tuyển chọn các dòng vi khuẩn cho từng vùng sinh thái bằng các thí... 2005) Nhìn chung vi sinh vật cố định đạm với cây lúa là rất đa dạng Một số chi vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định đạm phổ biến Chi Azotobacter Vi khuẩn Azotobacter được phân lập và đặt tên bởi nhà bác học Beyjeirinh vào năm 1901, là vi khuẩn cố định đạm hiếu khí tự do, thường phân bố ở các vùng đất, vùng nước có pH trung tính hoặc hơi kiềm Azotobacter là vi khuẩn hình cầu (song cầu khuẩn) , Gram âm,... Ruộng lúa ông Hứa Lập Điền Ấp Đôn Chụm, Xã Tập Sơn, Huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh 1.5 Những đóng góp của luận án - Phân lập được tập đoàn vi khuẩn gồm 380 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa trên môi trường Burk không đạm Dùng phương pháp so màu Indophenol Blue xác định cả 380 dòng đều có khả năng cố định đạm, 26 dòng vi khuẩn đã được khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây lúa cao sản ở giai đoạn mạ, 12 dòng. .. của các dòng vi khuẩn vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm cao - Một số kết quả của đề tài có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo và bổ sung giáo trình giảng dạy 4 * Ý nghĩa thực tiển - Cung cấp nguồn vật liệu ban đầu (6 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao hữu hiệu với cây lúa) cho các nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học phục vụ canh tác lúa - Kết quả đề tài góp phần cũng cố hướng nghiên... và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm Phạm vi nghiên cứu: Các dòng vi khuẩn vùng rễ lúa thu từ các mẫu đất thuộc 6 tỉnh thành thuộc khu vực ĐBSCL bao gồm thành phố Cần Thơ, tỉnh Vĩnh Long, tỉnh Hậu Giang, tỉnh Đồng Tháp, tỉnh Trà Vinh và tỉnh Kiên Giang có khả năng cố định đạm 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Quyết định công... trực tiếp canh tác Các nghiên cứu về vi sinh vật có ích trong trồng trọt ngày 1 càng được thực hiện nhiều hơn và hiệu quả của nhóm vi sinh vật này ngày càng được khẳng định Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh với rễ cây họ đậu đã được nghiên cứu và ứng dụng từ hơn 30 năm nay (Keyser et al., 1982) và đã trở nên phổ biến trong sản xuất Vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm cũng . PHA ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TRONG ĐẤT VÙNG RỄ LÚA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO CHO CANH TÁC LÚA . tài luận án Đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa đã được. đon vi khuẩn cố định nitơ trong đất vùng rễ lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tuyển chọn một số dòng có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa được tiến hành nhằm cung cấp một cái nhìn