Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HOÀI THU NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) DẠNG KHÔNG ĐỘC TỪ ĐOẠN GEN SEB TỰ NHIÊN ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 12/2014 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HOÀI THU NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) DẠNG KHÔNG ĐỘC TỪ ĐOẠN GEN SEB TỰ NHIÊN ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. NGHIÊM NGỌC MINH Hà Nội – 12/2014 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Hoài Thu Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cảm ơn! Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị, cũng như kinh phí để giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học và đặc biệt là TS. Bùi Văn Ngọc đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm chuyên môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc chuyên ngành Hóa sinh, các thầy cô giáo của Khoa đào tạo sau đại học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cùng với Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi học tập cũng như hoàn thành đề tài nghiên cứu. Đề tài được thực hiện trong khuôn khổ của đề tài cấp Nhà nước KC.04.14/11- 15: “Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố Staphylococcal enterotoxin B (SEB) của tụ cầu vàng” do PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh làm chủ nhiệm giai đoạn 2013 – 2015. Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Hoài Thu Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Tại Việt Nam 6 1.2. Giới thiệu về Staphylococcus aureus 8 1.2.1. Phân loại 8 1.2.2. Hình thái, đặc điểm sinh hóa 8 1.2.3. Các độc tố của Staphylococcus aureus 11 1.3. Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B 15 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc 15 1.3.2. Cơ chế gây độc 16 1.3.3. Những triệu chứng thường gặp 17 1.3.4. Các phương pháp phát hiện S. aureus và SEB 17 1.3.5. Protein tái tổ hợp SEB và tiềm năng ứng dụng 21 1.4. Hệ biểu hiện gen 23 1.4.1. Hệ biểu hiện E. coli 23 1.4.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) 24 1.4.3. Vector biểu hiện pET22b(+) 25 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 26 2.1.1. Vật liệu 26 2.1.2. Hóa chất 26 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 28 2.1.4. Thiết bị máy móc 28 2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 28 2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 29 2.2.3. PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony – PCR) 30 2.2.4. Tách dòng bằng vector pJET1.2/blunt 30 2.2.5. Xác định trình tự acid nucleic 31 2.2.6. Tạo đột biến điểm định hướng theo phương pháp Mega-primer 31 2.2.7. Phản ứng nối ghép gen 32 2.2.8. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến Escherichia coli 33 2.2.9. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 33 2.2.10. Cắt plasmid bằng enzym giới hạn 34 2.2.11. Tinh sạch phân đoạn DNA 34 2.2.12. Phương pháp biểu hiện gen đích trong chủng E. coli BL21(DE3) 35 2.2.13. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 35 2.2.14. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 36 2.2.15. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp 37 2.2.16. Phương pháp định lượng protein theo phương pháp Bradford 38 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.17. Phương pháp kiểm tra độc tính của protein tái tổ hợp 38 2.2.18. Phương pháp Western blot 40 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. Tách chiết DNA tổng số S. aureus và nhân dòng gen seb 42 3.1.1. Tách chiết DNA tổng số S. aureus 42 3.1.2. Nhân dòng gen seb 42 3.1.3. Xác định trình tự gen seb 44 3.2. Tạo đột biến điểm trên gen seb 45 3.2.1. Tạo gen seb đột biến 45 3.2.2. Xác định trình tự gen seb đột biến 47 3.3. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen seb đột biến 48 3.3.1. Thiết kế vector pET22(b+) mang gen seb đột biến 48 3.3.2. Giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện 49 3.4. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb đột biến trong tế bào E. coli BL21 và tinh sạch protein mtSEB 50 3.4.1. Biểu hiện gen seb đột biến trong tế bào E. coli BL21 50 3.4.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen seb đột biến 51 3.4.3. Tinh sạch ptotein tái tổ hợp mtSEB 55 3.4.4. Xác định hàm lượng protein mtSEB theo phương pháp Bradford 57 3.5. Đánh giá tính kháng nguyên của protein mtSEB 58 3.6. Đánh giá độc tính của protein mtSEB trên động vật thử nghiệm 58 3.6.1. Đánh giá độc tính giữa protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 1xLD 50 và lô đối chứng 58 3.6.2. Đánh giá độc tính giữa protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 3xLD 50 60 3.6.3. Đánh giá độc tính giữa protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 10xLD 50 61 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 75 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl Microliter APS Ammonium persulphate bp Base pair BSA Bovine serum albumin dH 2 O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid Kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria - Bertani LD 50 Lethal dose, 50% ml Milliliter mtSEB Mutant SEB OD Optical density PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid S. aureus Staphylococcus aureus SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật ii SEB Staphylococcal enterotoxin B SEs Staphylococcal enterotoxins TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TEMED N,N,N ,N -Tetramethylethylenediamine v/p Vòng/phút v/v volume/volume w/v Weight/volume wtSEB Wild type SEB [...]... Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên < /b> cứu < /b> tạo < /b> kháng < /b> nguyên < /b> tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> Staphylococcal < /b> enterotoxin < /b> B (SEB) dạng không độc từ đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên < /b> liệu phục vụ cho việc chế tạo < /b> que thử phát hiện nhanh độc tố SEB Mục tiêu nghiên < /b> cứu < /b> Tạo < /b> được kháng < /b> nguyên < /b> SEB mất độc tính hoặc có độc tính thấp và vẫn đảm b o tính kháng < /b> nguyên < /b> để ứng dụng cho việc tạo < /b> kháng.< /b> .. lên que thử nhanh để phát hiện nhanh độc tố SEB của tụ cầu vàng Nội dung nghiên < /b> cứu < /b> - Tách dòng và xác định trình tự của gen seb tự nhiên có kích thước khoảng 534 bp được phân lập từ chủng S aureus ở Việt Nam - Tạo < /b> gen seb đột biến điểm ở 04 vị trí b ba mã hóa lần lượt là 12, 32, 105 và 121 để thay thế amino acid Histidine thành Tyrosine - Thiết kế vector biểu hiện mang gen seb đột biến, biểu hiện. .. việc nghiên < /b> cứu < /b> tạo < /b> ra kháng < /b> nguyên < /b> tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> không những loại b được độc tố mà còn giữ nguyên < /b> được đặc tính miễn dịch như kháng < /b> nguyên < /b> dại để gây miễn dịch sản xuất kháng < /b> thể K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên < /b> sinh vật 1 Luận văn thạc sỹ sinh học Nguyễn Thị Hoài Thu đơn dòng, đa dòng kháng < /b> SEB là cần thiết và đây là nguồn nguyên < /b> liệu quan trọng chế tạo < /b> que thử phát hiện nhanh SEB phục vụ nhu cầu hiện. .. mang gen seb đột biến, biểu hiện và tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng biểu hiện gen seb đột biến - Tinh sạch, định lượng protein tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> SEB dạng đột biến và đánh giá tính kháng < /b> nguyên < /b> của protein tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> mtSEB b ng phương pháp Western blot - Kiểm tra độc tính của protein tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> SEB trên động vật thử nghiệm K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên < /b> sinh vật 2 Luận văn thạc sỹ... hoặc dạng khí phun trong không khí SEB b n với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus (Jones, Khan, 1986) Như vậy, làm thế nào để chúng ta có phát hiện và phòng ngừa các b nh do độc tố này Theo các nghiên < /b> cứu < /b> trên thế giới, có nhiều phương pháp làm giảm hay mất hoàn toàn độc tố của SEB nhằm phục vụ cho nghiên < /b> cứu < /b> biểu hiện SEB hay xa hơn nữa là nghiên < /b> cứu.< /b> .. độc tố (siêu kháng < /b> nguyên)< /b> do S aureus sản sinh kể trên thì nội độc tố ruột nhóm B (Staphylococcal < /b> enterotoxins B - SEB) là một độc tố mạnh, b n với nhiệt và hòa tan trong nước, chúng có phổ phân b rộng rãi và là nguyên < /b> nhân gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm thường gặp nhất B n cạnh đó, SEB có khả năng kháng < /b> kháng sinh (Van der Donk et al., 2013), ví dụ tính kháng < /b> nhóm ß-lactam như methicillin (Monaco... seb từ các chủng khác nhau đã được công b trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) như gen từ PM36 (mã số AB479118), gen từ chủng ATCC14458 (mã số AY518386), gen từ chủng COL (mã số CP000046)… SEB hoàn chỉnh bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 amino acid ở đầu N (Jones, Khan, 1986) Đoạn peptide tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ b ... của SEB nhằm đánh giá nguy cơ ngộ độc là vô cùng quan trọng Hiện nay, một số hãng trên thế giới đã sản xuất que thử phát hiện trực tiếp độc tố SEB như: hãng Tetracore, hãng Advnt, hãng Alexeter… Tuy nhiên, các que thử này giá thành cao, không phù hợp < /b> với điều kiện kinh tế Việt Nam; kháng < /b> nguyên < /b> trong nước có thể biến đổi không phù hợp < /b> với que thử nhập ngoại và nếu nhập que thử nhanh, chúng ta sẽ không. .. lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau, trình tự gen seb đã được công b trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) với các chủng khác nhau như PM36 (accession number: AB479118), ATCC14458 (accession number: AY518386), COL (accession number: CP000046), DQ997830… Sau khi tiến hành thu thập các trình tự gen seb quan tâm trên ngân hàng gen quốc tế (www.ncbi.nlm.nih.gov) và phân tích trình tự gen b ng phần mềm CLC Sequence... ngộ độc thực phẩm do SEB gây nên Năm 1997, Woody và cộng sự đã nghiên < /b> cứu < /b> tạo < /b> được 2 loại protein SEB mang đột biến thay thế asparagine b ng lysine tại vị trí 23 (N23K) và phenylalanine b ng serine tại vị trí 44 (F44S) trên trình tự polypeptid SEB không độc Theo đó, khi thử nghiệm 10 µg SEB N23K và F44S (tương đương liều 30 LD50) đã không gây chết chuột thử nghiệm Một điều thú vị là mặc dù protein SEB . NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) DẠNG KHÔNG ĐỘC TỪ ĐOẠN GEN SEB TỰ NHIÊN ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ. thực hiện đề tài: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng không độc từ đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên liệu phục vụ cho việc chế tạo que thử phát hiện. TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HOÀI THU NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) DẠNG KHÔNG ĐỘC TỪ ĐOẠN GEN SEB TỰ NHIÊN ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU