Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỘC Sư PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYÊN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINHCELLƯLASE TRONG ĐẤT ĐÒI TẠI KHU Vực XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hưởng dẫn: PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân huỷ cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Enzyme cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết (3-1,4-O-glycoside trong phân tử cellulose, olygosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác. Hiện nay, việc sử dụng các enzyme như cellulase trong một số ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phấm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, sản xuất dung môi hữu cơ và đặc biệt trong xử lý rác thải hữu cơ là vấn đề đang được con người đặc biệt quan tâm. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được enzyme cellulase có nhiều khả năng và trìên Võng giải quyêt vân đê nêu trên trõtĩg giám định và xử lý ô nhiễm môi trường. Chúng có thế hoạt động trên chất thải khó xử lý, làm thay đổi đặc tính của chất thải và đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn. Enzyme cellulase được sinh tổng họp bởi nhiều loài khác nhau như: các loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động vật nguyên sinh. Ngoài ra, cellulase còn có ở các loài sinh vật khác như thực vật và động vật.Trong số các nhóm vi sinh vật nêu trên thì xạ khuấn phân giải cellulose là một trong những đối tượng đã và đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Xạ khuẩn trong đất là một trong các nhóm sinh vật đất có số lượng lớn. Chúng chiếm tới 10 - 70 % số tế bào vi sinh vật trong đất. Ở môi trường trung tính xạ khuẩn phát triển mạnh nhất trong đất giàu hữu cơ và thông thoáng. Xạ khuẩn có vai trò phân giải chất hữu cơ và nhất là phân giải đường tan trong nước, hemicelluỉose và cellulose. Xạ khuẩn tham gia vào quá trình hình thành các acid mùn. Một vài loài xạ khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do từ khí trời khi cộng sinh với thực vật thuộc bộ đậu. Xạ khuẩn là vi sinh vật tạo ra kháng sinh chủ yếu (tới 80 % chất kháng sinh) vì thế trong đất có nhiều xạ khuẩn cây trồng ít bị bệnh hơn [8]. Phường Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có diện tích tự nhiên là 423,9 ha, trong đó đất diện tích đất đồi (lâm nghiệp) là 22,3 ha. Đất này có thành phần cơ giói nhẹ, thường có kết cấu kém hoặc không có kết cấu, tầng đất mỏng do dễ bị rửa trôi, hàm lượng mùn thấp [11]. Do vậy, việc khảo sát các chủng xạ khuẩn trong đất đồi có khả năng phân hủy cellulose cao là việc có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc cải tạo đất và bảo vệ môi trường. Xuất phát tù’ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose góp phần tăng độ phì nhiêu của đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Sơ lược đặc điểm tự nhiên khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3.2. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn từ đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3.3. Đặc điểm hình thái của cuống sinh bào tử, bào tử và tính chất nuôi cấy của 2 chủng Đ4, Đ12 2 3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của 2 chủng xạ khuẩn Đ4, Đ12. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cún Một số chủng xạ khuấn có khả năng phân giải cellulose từ đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc; thời gian nghiên cứu từ tháng 7 năm 2012 đến tháng 7 năm 2013. 5. Phương pháp nghiên cửu 5.1. Phương pháp lấy mẫu 5.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 5.3. Phương pháp bảo quản chủng giống 5.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 5.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn 5.6. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuấn 5.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 6. Những đóng góp mói của đề tài Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một sô chủng xạ khuân có khả năng sinh enzyme Cẽllulãsẽ trõíig đât đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn Xạ khuấn (Ạctinomycetes) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn, nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác của thảm thực vật. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số vsv [32]. Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường. Chúng có nhiều trong các lóp đất trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lóp đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong các lóp đất rất kiềm, số lượng xạ khuấn cũng thay đối theo thời gian trong năm. Xạ khuẩn tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đât, nước, dung đê sản xuât nhiêu enzyme như protéase, amylase, cellulase một số acid amin và acid hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [6]. 3 1.1.1. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử. 1.1.1.1. Đặc đỉêm hình thải và tỉnh chât nuôi cây Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Đe làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điếm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử. dựa vào đặc điểm hình thái người ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính: Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tủ' rõ rệt, sinh sản bằng bào tủ’ và phân hóa thành HSKS và HSCC. Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tương tự nang bào tử. Nhóm 3: Gồm các xạ khuấn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt hệ sợi. Nhóm 4: Gồm các xạ khuấn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có hình chữ V,T thường không có hệ sợi. Dựa vào nghiên cứu các xạ khuấn trên các môi trường khác nhau người ta chia hình chuỗi bào tử thành 6 kiểu: + Kiểu s (Spira): chuỗi bào tủ’ xoắn. + Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn. + Kiểu SRJF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tủ* xoắn, cong đến thẳng. + Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa. + Kiểu RA - RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử có móc hay xoắn không hoàn toàn. + Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lượn sóng. Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản 4 dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, như ta đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thế giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy, để phân loại được chính xác, ngày nay người ta cần nghiên cứu thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử [24]. 1.1.1.2. Đặc điểm hóa phân loạỉ( Chemotaxonomỵ) Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào vsv. Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau: Type thành phần tế bào dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành phần pettide và đường trong thành phần tế bào hay các polysaccaride gắn vào thành tê bào. Type peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptide của PG cầu nối peptide và các liên kết giữa các mắt xích của PG. Acid mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocarcỉỉa, Rhodococus, Mycobacterỉum và Cornebacter. Đây là đặc điếm phân loại cơ bản cho các chi đó. Acid béo thường được sử dụng trong phân loại là acid béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của acid 10 - metylloctade canoit (acid tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [8]. Phospholipid có 5 type (P[, pir, Pin, Piv, Pỵ) có thành phần đặc trưng, có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn. Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất. Khi muốn đưa một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào. 1.1.1.3. Đặc điếm sinh lý, sinh hóa Đe phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống ezyme. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn. 5 Hop wood (1997) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại. Dõ đó, tính không ôn định và biên dị Cãõ của xạ khuân mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hoá để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi [25]. 1.1.1.4. Phân loại so (Numerical taxonony) Đe phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phương pháp này dưạ trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vsv theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Đẻ so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số s - Similarity) có 2 công thức tính hệ số s hay được sử dụng. Công thức của Sokal và Michener (SSM) SsM (AB)= (Ns+ + Ns_)* 100/ (Ns+ + Ns_ + Nd) Trong đó: SsM(AB) ■ Mức độ giống nhau giữa hai cá thê A, B (%). Ns + : Sô các tính trạng giông nhau. Nd : So các tính trạng khác nhau. Ns. : Sô các tính trạng đôi lập nhau. Công thức của Jacard (Sj) S«AB)=Ns* 100/ (Ns + Nd) Trong đỏ: sJ(AB) ■ mức độ giông nhau giữa hai chủng A, B (%). Ns : Tông số các đặc điêm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh. Nd : Tống sô các đặc điêm khác nhau (tông sô các đặc điêm dương tínhcủa chủng này và âm tỉnh của chủng kia). Ket quả của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu “rễ cây”) của các thông số. Dựa vào sơ đồ này nhũng chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm vói những đại diện nhất định [33]. ]. 1.1.5. Phân loại xạ khuấn chi Streptomyces Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Hemici đặt tên năm 1943 [32]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triến phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuấn khoảng 1-10 |Lim, khuấn lạc thường không 6 lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Be mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có kỵ nước. Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử- Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy. Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy, ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường và phương pháp chung đế phân loại nhóm vsv này. Các loại xạ khuấn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuấn Gr+, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 30°c, pH tôi ứu 6,5 - 8,0. Một sô loài có thê phát triên ở nhiệt độ Câo hơn hoặc thâp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh). Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuấn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. Cho đến nay để xác định cho thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [32]. 1.1.2. Đặc điếm sinh học cửa xạ khuấn 1.1.2.1. Đặc điếm hình thái của xạ khuấn * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuấn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đối trong khoảng 0, 2 - 1,0 ụm đến 2,0 - 3,0 ịim, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[18]. Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không on định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 - 50 |im, dễ quan sát bằng mắt thường. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng 7 màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy vào loài và tùy vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ấm Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 nm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1 cm hoặc lớn hon. Khuẩn lạc có 3 lóp, lóp vỏ ngoài có dạng sợi bền chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lóp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc to, enzyme, vitamin, acid hữu cơ có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường. * Khuẩn ty Trên môi trường đặc biệt, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào trong môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triến trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi sinh khí (khuấn ty sinh khí aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporỉchthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng. 1.1.2.2. Câu tạo của xạ khuân Xạ khuấn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gr+, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10-20 nm có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày 60 - 120A°, khi già có thể đạt tới 150 - 200A°, lóp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A°, lóp trong dày khoảng 50A°. các lóp này chủ yếu cấu tạo từ các lóp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết glucoside. Khi xử lý bang lyzozyme, các liên kết 1,4 glucoside bị cắt đứt, thành tế bào bị phá hủy tạo thành thể sinh chat (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá hủy khi xử lý tế bào hỗn họp este chloroform và các dung môi hòa tan lipid khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS có nhiều lipid hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kittin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quà trình vận chuyển các chất qua màng tế bào [22], [23], [26], [28], [29]. Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [3], 8 [7]. Nhóm /: thành phần chính của thành tế bào là acid L- 2,6 diaminopimelic (L -ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này. Nhóm II'. thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6 - diaminopimelic (m - ADP) và glyxin. Nhóm III: thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6 - diaminopimelic. Nhóm IV\ thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6 - diaminopimelic, arabinose và galactose. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là phospholipid và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Nguyên sinh chất nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol). Tuy nhiên, điếm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ Gr+ c rất cao trong DNA, thường lớn hon 55%, trong đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45% [9]. Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram+ nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiêm săc thê còn có các yêu tô di truyên ngoài nhiêm săc thê, chúng có thê tự nhân lên, được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số họp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyến gene, sản xuất chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [2]. Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hũu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amon Khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau. 1.1.2.3. Đặc đỉêm sinh lý, sinh hóa của xạ khuân Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, acid hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon. Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt đế làm nguồn nitơ. ở các loài khác nhau thì các loài hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển là 25 - 30°c. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trường có pH là 6,8 - 7, một số ít có khả năng 9 phát triến tốt trong môi trường kiềm [14]. Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gr+, đặc biệt khác với các sinh vật khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó vi khuẩn khá thấp (25 - 45%). Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA. Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose ) [14]. Đặc điếm sinh lý của xạ khuấn Streptomyces Chi Streptomyces có sô lượng lõài mô tả lớn tthât, chi này có HSKS, HSCC phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thường không lớn, đường kính khuấn lạc từ 1 - 5 mm. Khuấn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề mặt khuấn lạc thường được phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi khi không thấm nước. Chuỗi bào tủ’ được tạo thành trên cuống sinh bào tủ’, chúng có thể thẳng, lượn sóng hoặc xoắn. Be mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có lông hoặc có gai. Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau, sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trường. Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành của vi khuẩn Gr+, là vi sinh vật hiếu khí, dị dưỡng. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là từ 25 - 30°c, pH tối ưu là 6,5-8. Một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và xạ khuẩn ưa ẩm). 1.1.3. Vai trò của xạ khuân Xạ khuấn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu cho đất. Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyến hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose, mùn, kitin, ketratin, lignin [18]. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [9]. Trong đó có trên 15% có nguồn gốc tò các xạ khuấn hiếm như Actỉnomadura, Mỉcromonospora, Actỉnoplanes, Streptovertỉcillium, Streptosporangium, Điều đáng chú ý là các xạ khuấn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học, thú y học, bảo vệ thực vật như gentamycin, tobramycin, vancomycin, rosamycin, tetraxycline Bên cạnh đó trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều chất hữu cơ. Trong đó, điển hình là các enzyme ngoại bào (cellulâsê, prõtêâse ), vitamin nhóm B (Bi, B2, B5,Bò B12), một SO acid hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [18]. 1 [...]... không có HSKS thì khu n lạc có dạng màng dẻo[8], [12] Hình ảnh khu n lạc của xạ khu n được dẫn ra trên hình 3.1 Hình 3.1 Khu n lạc của xạ khu n Sau 3 ngày phát triến khu n lạc xạ khu n có kích thước khoảng 0,5 - 2 mm Tuyển chọn các chủng xạ khu n theo tiêu chuẩn: có sự bông, xốp, khô, có màu đặc trung, nhìn kỹ có dạng sợi nấm, dạng phóng xạ, có thể có vòng vô khu n bao quanh, khu n lạc to Các chủng xạ khu n. .. trên đất trống đồi trọc vô tình sẽ làm khô cằn và nghèo nàn đất đai, sau một vài chu kì đất thường chua hoặc rất chua [15] Nhìn chung, đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có thành phần cơ giới nhẹ, thường có kết cấu kém hoặc không cỏ kết cấu, tầng đất mỏng do dê bị rửa trôi, hàm lượng mùn thấp 3.2 Phân lập, tuyển chọn xạ khu n từ đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3.2.1 Đặc điểm khu n. .. các loại vsv này đều có khả năng phân giải cellulose Nhưng có thể phân biệt rõ ràng các khu n lạc này: Khu n lạc vi khu n thường nhày, ướt và nhẵn; khu n lạc nấm mốc cũng có nhiều màu sắc như khu n lạc xạ khu n nhưng khác ở chỗ nó phát triến nhanh và to hơn khu n lạc xạ khu n nhiều lần; khu n lạc xạ khu n thì bông, xốp, khô, rắn chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, nhìn kỹ có dạng sợi nấm nhung... bón vi sinh thì sẽ là một nguồn lợi lớn Vì vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có những nghiên cún về khả năng sinh cellulase của các vật trong đất để phân giải cellulose từ các phế phẩm nông nghiệp visinh Đặc biệtxạ khu n là một loài vi sinh vật có khả năng sinh cellulase khá mạnh và có thể cho nguồn enzyme dồi dào phục vụ cho việc xử lý rác thải, chế biến thức ăn gia súc probiotin Khả năng sinh tổng...Ngày nay xạ khu n còn được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp lên men, chế tạo các sản phấm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này vào đời sống do một số xạ khu n có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng 1 tạo thành chất kích thích sinh trưởng cho thực vật 1.2 Nhu cầu dinh dưõìig của xạ khu n Theo Nguyễn Thành Đạt trong quá trình... họp cho xạ khu n nhất trong 3 loại đất lấy mẫu Lá cây keo dễ phân hủy, rất thích hợp để chống xói mòn, tạo độ mùn cho đất; rễ có nốt sần cố định đạm nên có khả năng cải tạo, phục hồi đất nghèo dinh dưỡng [13] Vì vậy, số chủng xạ khu n phân lập được trên loại đất này là nhiều nhất Ngược lại, những loại đất nghèo dinh dưỡng, có độ ẩm không thích họp và đặc biệt là có pH quá cao hay quá thấp, xạ khu n phân... hoại sinh, hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25 - 30°c, độ ẩm thích hợp từ 40 - 50%, độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ Đất đồi khu vực Xuân Hòa có kết cấu kém, tầng đất mỏng do dễ bị rửa trôi, hàm lượng mùn thấp; ở độ sâu 5 cm, 10 cm, 15 cm có những điều kiện tối ưu về độ ẩm, nhiệt độ, độ pH cho sự sinh trưởng và phát triển của xạ khu n Qua kết quả phân lập xạ khu n từ đất đồi tại Xuân Hòa,. .. khu n từ đất đồi tại Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc thu được kết quả sau: Phân lập được 17 chủng xạ khu n có khả năng phân giải cellulose Môi trường Gause I có thành phần môi trường thích hợp nhất với sự phát triển 3 của xạ khu n nên khu n lạc xạ khu n mọc trên môi trường này nhiều hơn 2 môi trường Czapeck - glucose và Czapeck - tinh bột, vì vậy phân lập được nhiều xạ khu n từ môi trường này ơ độ sâu... đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3.2.1 Đặc điểm khu n lạc Từ các mẫu đất đồi lấy ở độ sâu 0 cm - 30 cm tại các địa điểm khác nhau thuộc khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 17 chủng xạ khu n Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2 Các chủng xạ khu n phân lập từ đất đồi Vị trí Tính pH Đ Loại đấ chất Gause I ô đât t thảm sâ lấy XV u mẫu A,B 4.8... ấm có khả năng phân giải bột cellulose và CMC Nguyễn Đức Lượng và cs (1999) nghiên cứu một số tính chat enzyme Cêllulasẽ củâ 1 xậ khu n Actinomyces griseus và nhận thây Cẽllulasẽ củâ Xậ khu n hoạt động mạnh ở 50°c và pH tối ưu là 7 [34] Việt Nam là đất nước sản xuất nông nghiệp là chủ yếu nên việc nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của xạ khu n có triển vọng rất lớn 1.4.2 Úng dụng của cellulase . cứu một số chủng xạ khu n có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu một số chủng xạ khu n có khả năng phân giải cellulose. đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Sơ lược đặc điểm tự nhiên khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3.2. Phân lập, tuyển chọn xạ khu n từ đất đồi khu vực. đến khả năng sinh cellulase của 2 chủng xạ khu n Đ4, Đ12. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cún Một số chủng xạ khu n có khả năng phân giải cellulose từ đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh