LÒÌ CẢM ƠN Bằng tầm lòng cảm ơn sâu sắc, tỏi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trương Văn Châu đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt quả trình thực hiện để tài. Tôi xỉn bày tỏ lòng biết ơn tới các, thầy cô trong Ban giảm hiệu, phòng Sau đại học và khoa Sinh - Kĩ thuật nông nghiệp trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, là nơi tôi được đào tạo về kiến thức cơ bản, chuyên môn trong sinh học thực nghiệm và đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quả trình học tập, thực hiện luận vãn này. Tôi cũng xỉn bày tỏ lòng cảm ơn tới lãnh đạo sở GDĐT Hà Nội, tập thê sư phạm trường THPT Đa Phúc đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập nâng cao trình độ chuyên môn đế hoàn thành luận vẫn này. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn quan tâm, giủp đỡ tôi thực hiện luận văn. Xỉn chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 07 nẫm 2013 Học viên Đặng Thủy Hồng LỜI CAM ĐOAN Tôi xỉn cam đoan những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là do tôi thực hiện và không trùng lặp với bất cứ tác giả nào khác. Tôi xỉn hoàn toàn chịu trách nhiệm đôi với những nội dung được để cập trong bản luận văn này. Hà Nội, ngày 03 tháng 07 năm 2013 Học viên Đặng Thủy Hằng Lòi cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các hình, biếu đồ Danh mục các bảng Danh mục chữ viết tắt MỤC LỤC 3.1 3.1.1. Quy trình tách các phân đoạn dịch chiết từ cây cỏ sữa lá to DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIÉU ĐỒ BP Béo phì Cho Cholesterol ĐTĐ Đái tháo đường EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol Glu Glucose HDL Lipoprotein tỷ trọng cao (High-density lipoprotein) LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low-density lipoprotein) n-hex n-hexan PĐ Phân đoạn STZ Streptozotocin TG Triglycerid MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài. Sự phát triển của nền kinh tế xã hội thời hiện đại đã làm cho đời sống con người được nâng cao rõ rệt. Tuy nhiên, cuộc sống ngày càng phát triến thì bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) ngày càng phát triển mạnh mẽ. Tỉ lệ tử vong do ĐTĐ gây ra đứng thứ ba thế giới sau bệnh tim mạch và ung thư. Hiện nay, trên thế giới với những thống kê mới nhất về bệnh tiểu đường, nhất là loại 2, hết sức đáng lo ngại. Tại Mỹ, hiện nay có ít nhất 25 triệu người mắc và sẽ tăng lên tới 60 triệu trong 10 năm tới nếu không có gì thay đổi trong nếp sống của người dân khi những người ở trong tình trạng tiền tiểu đường (prediabetic) trở thành bị tiểu đường thực sự. Tại các nước Châu Á tỉ lệ những người mắc bệnh đái tháo đường cũng tăng lên mạnh mẽ. Tại Ân độ tỷ lệ bệnh tiều đường hiện nay đã chiếm 20 % tổng số người bị tiểu đường trên thế giói khiến châu Á sẽ là một mỏ vàng hiện nay cho các công ty dược phẩm chế tạo thuốc trị bệnh tiểu đường và các thiết bị đo đường trong máu. Tổ chức WHO tiên đoán vào năm 2025 thì Ãn Độ và sau đó là Trung Quốc sẽ dẫn đầu thế giới về tỷ lệ bệnh tiểu đường. Ở Việt Nam số người mắc bệnh ĐTĐ năm 2007 khoảng 2 triệu người và cho đến nay vào khoảng 5 triệu người. Như vậy bệnh ĐTĐ đã thực sự trở thành gánh nặng kinh tế, tinh thần và mối lo ngại lớn cho nhiều quốc gia trên thế giới. Hiện tại, để điều trị đái tháo đường có các thuốc kinh điển gồm sulphonylurea, metformin, glitazone, insulin là những thuốc mang lại hiệu quả rất tốt nếu biết dùng đúng cách, tuy nhiên các loại thuốc này cũng kèm theo khá nhiều những phản ứng phụ không mong muốn, và khá tốn kém trong điều trị nên chưa phù hợp với tình trạng kinh tế của người dân Việt Nam. Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao có mạch, trong đó có tới 4000 loài mà 5 nhân dân ta dùng làm thảo dược. Hơn nữa Việt Nam lại là đất nước có nền Y học dân tộc cổ truyền lâu đòi. Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng cây cỏ có sẵn trong tự nhiên để trị bệnh. Ngày nay, cùng với nhiệm vụ công nghiệp hóa và hiện đại hóa đất nước, thì một trong những nhiệm vụ cơ bản là phải đảm bảo sự phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên đất nước, tận dụng nhũng lợi thế về tài nguyên thiên nhiên sẵn có của quốc gia vào phục vụ cho đời sống con người. Trong đó được đặc biệt quan tâm là việc sử dụng các họp chất tự' nhiên từ thực vật trong lĩnh vực Y - Dược học. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, các họp chat polyphenol (một nhóm các hợp chất tự nhiên từ thực vật) đang được ngày càng ứng dụng rộng rãi trong điều trị nhiều loại bệnh trong đó có cả bệnh đái tháo đường - một căn bệnh phổ biến và nguy hiểm ngày nay [4], [9], [10], [12]. Chính vì vậy, việc nghiên cún, khảo sát về thành phần hoá học và đặc tính sinh dược học của các cây thuốc có giá trị tại Việt Nam nhằm đặt cơ sở cho việc sử dụng chúng vào điểu trị ĐTĐ một cách họp lí, hiệu quả có tẩm quan trọng đặc biệt. Cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L.) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) là một trong số đó. Cỏ sữa lá to chỉ thấy phân bố ở một số nước thuộc khu vực nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á gồm Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Lào, Việt Nam và một số nơi ở phía nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, Cỏ sữa lá to phân bố tương đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh, từ đồng bằng đến miền núi, trù’ vùng núi cao lạnh. Cây ưa ấm, ưa sáng và có thể hơi chịu bỏng, thường mọc trên đất ẩm, còn tương đối mầu mỡ, lẫn với các loài cở khác trên các bãi hoang, vườn nhà hay ruộng trồng hoa màu (ngô, đỗ l ạ c . . B ộ phận dùng làm thuốc là toàn cây dùng tươi hoặc phơi khô, sấy khô. Theo y học cổ truyền, cỏ sữa lá to có vị chua, the, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, chữa lỵ, phong ngứa và thông sữa. Tuy nhiên việc nghiên cứu đặc tính hóa sinh, y dược của các hoạt chất thiên nhiên từ đối tượng này với việc điều trị bệnh tiểu đường chưa được nghiên cứu một 6 cách thỏa đáng. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây cỏ sữa lá to cEuphorbia hirta L.)”. 2. Mục đích nghiên cứu - Đánh giá hoạt tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết tù’ cây Cỏ sữa lá to ( Euphorbia hỉrta L.) - Bước đầu nghiên cứu tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết đối với bệnh Đái tháo đường và rối loạn trao đổi lipid. 3. Nhiệm vụ nghiên cún - Định tính, định lượng họp chất thứ sinh trong một số phân đoạn dịch chiết tù’ cây Cỏ sữa lá to ( Euphorbia hỉrta L.) - Nghiên cứu đặc tính hóa sinh của một số phân đoạn dịch chiết. - Nghiên cứu tác động hạ đường huyết và chống rối loạn trao đổi lipid trên mô hình chuột BP và ĐTĐ của các phân đoạn dịch chiết từ cây cỏ sữa lá to ( Euphorbia hỉrta L.) 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu 4.1.1 Mau thực vật + Cỏ sữa lá to ( Euphorbia hỉrta L.) + Bộ phận sử dụng: Toàn cây + Địa điểm thu mẫu: Dược Thượng - Tiên Dược - Sóc Sơn -Hà Nội 4.1.2 Mầu động vật + Chuột nhắt trắng là chủng Swiss 4 tuần tuổi ( 18-20g), do viện vệ sinh dịch tễ TW cung cấp. 4.2. Phạm vi nghiên cún Nghiên cứu đặc tính sinh dược của một số phân đoạn dich chiết từ cây Cỏ sữa lá to ( Euphorbia hirta L.) trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm, chuột béo phì gây đái tháo đường mô phỏng theo type 2. 5. Phương pháp nghiên cún 7 5.1. Phương pháp hóa lý: sử dụng các hệ dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau nhau để tách một số phân đoạn dịch chiết chứa các hoạt chất thiên nhiên từ cây cỏ sữa lá to ( Euphorbia hỉrta L.) 5.2. Sử dụng các phương pháp hóa sinh: Định tính, định lượng, nghiên cứu đặc tính hóa sinh của các phân đoạn dịch chiết. 5.3. Tạo mô hình chuột BP: Chuột nhắt trắng chủng Swiss (18-20g) sau 3 ngày thích nghi với điều kiện phòng thí nghiệm, được nuôi bằng chế độ ăn giàu lipid [14] trong thời gian 4 tuần, khi đó chuột nuôi bằng chế độ ăn giàu lipid tăng có ý nghĩa thống kê so với chuột nuôi bằng thức ăn thường. 5.4. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2: chuột nuôi BP được gây ĐTĐ type 2 bằng tiêm STZ dưới màng bụng. Sau 3-4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định >18mmol/l [12], [14]. 5.5. Sử dụng phương pháp hóa sinh - y dược để định lượng đường huyết [11], [13] và một số chỉ số hóa sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid [9] ở chuột nhắt và sau khi điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết từ cây cỏ sữa lá to ( Euphorbia hirta L.) (phân tích một số chỉ số Glucose, Triglycerid, cholesterol, LDL - Lipoprotein tỉ trọng thấp, HDL - Lipoprotein tỉ trọng cao) 6. Những đóng góp mói của đề tài luận văn - Cung cấp những dẫn liệu khoa học về thành phần hóa học và hàm lượng các nhóm chất hữu cơ trong phân đoạn dịch chiết từ cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta h.) - Xác định được một phân đoạn dịch chiết có khả năng hạ đường huyết và giảm béo phì từ cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hỉrta L.J CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Họp chất tự nhiên ở thực yật Ở thực vật, ngoài protein, saccarid, lipid, vitamin, còn có những chất khác có 8 vai trò quan trọng trong trao đối chất của cây được gọi là các chất thực vật thứ sinh (plant secondary substance). Căn cứ vào tính chất hóa học, các họp chất thực vật thứ sinh được chia thành một số nhóm chính như: nhóm phenolic, nhóm terpen và nhóm alkaloid. 1.1.1. Họp chất phenolic 1.1.1.1. Giói thiệu chung Các hợp chat phenolic có đặc điểm chung là cấu trúc hoá học có chứa nhóm chức hydroxyl (-OH) liên kết trực tiếp với vòng hydrocacbon thơm. Phenolic thường là những họp chất có hoạt tính sinh học mạnh, một số có tác dụng dược lý và được ứng dụng rộng rãi trong y dược [21]. 1.1.1.2. Phân loại Dựa vào thành phân và câu trúc người ta chia họp chât phenolic thành 3 nhóm: hợp chat phenolic đơn giản, hợp chat phenolic phức tạp và hợp chất phenolic đa vòng [21]. Nhóm họp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng benzene và một vài nhóm hydroxyl. Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol. Nhóm họp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử của chúng ngoài vòng thơm benzene (Cô) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh. Đại diện nhóm này có axid cyamic, axid ceramic. Nhóm họp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chat phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân. Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng. Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin. 1.1.1.3. Tác dụng sinh học Hợp chất phenolic có ở hầu hết các bộ phận của cây đặc biệt là tế bào thực vật 9 quang họp. Chúng được hình thành tù’ những sản phẩm của quá trình đường phân pentose qua acid cynamic hay theo con đường acetat malonat qua Acetyl-CoA [21]. Nhóm hợp chất này có các chức năng như sau: - Các họp chat phenolic tham gia vào quá trình hô hấp với vai trò như là một chất vận chuyển hydro. - Các polyphenol có thế hình thành liên kết hydro với các protein và các enzyme làm thay đổi hoạt động của enzyme, thường làm tăng hoạt động của enzyme. - Hợp chất phenolic có tác dụng mạnh lên quá trình sinh trưởng của thực vật. Trong đó phenol đóng vai trò là chất hoạt hoá enzyme IAA-oxydase, ngoài ra nó còn tham gia vào sự sinh tổng hợp enzyme. Phenol cũng được xem như chất điều khiển các chất điều hoà sinh trưởng ở thực vật. - Họp chat phenolic thường có tính kháng khuẩn. Nó được hình thành để chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn, đặc biệt là ở các vết thương do tác dụng cơ học hoặc do vi khuẩn tạo nên. Phản ứng này giống phản ứng kháng nguyên - kháng thể ở động vật. Các họp chat phenolic có vai trò quan trọng trong việc liền sẹo, nó có tác dụng làm nhanh quá trình tái sinh, chống lại bức xạ, chống lại tác nhân gây đột biến và các tác nhân oxy hoá. Nguyên nhân để hợp chất phenolic có tác dụng chống oxy hoá là do chúng có khả năng kết hợp với các gốc tự do trong cơ thể. Chúng có vai trò như là các “bẫy” của các gốc tự do, ức chế sự oxy hoá của a - tocopherol trong cholesterol “xấu”, tái chế a- tocopherol đã bị oxy hoá và loại bỏ các ion kim loại. - Hàm lượng polyphenol trong cây biến động trong phạm vi rất rộng. Hàm lượng này tuỳ thuộc vào từng loài và điều kiện sinh thái. Ví dụ trong điều kiện lạnh, cây tích luỹ nhiều antoxyan xanh và tím, các flavonoid như flavonol và antoxyan có vai trò điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang họp [21 ]. 1 0 [...]... cách l y 20 ịi\ để định l ợng tương tự như đã l m với mẫu chuẩn aicd gallic 2.2.3 Nghiên cún tác dụng của dịch chiết các phân đoạn cây cỏ sữa l to (Euphorbia hirta L. ) l n trọng l ợng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột BP thực nghiệm 2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD50 Xác định LD50 của dịch chiết cây cỏ sữa l to theo phương pháp Lorke [17] Chuột nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm được phân l ... xâm nhập vào tế bào ß qua kênh vận chuyến glucose GLUT2 Hoạt động của nó trong tế bào l m tổn thương và alkyl hóa ADN và cuối cùng dẫn tới hoại tủ’ tế bào Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của nó, đặc biệt l ở vị trí o6 cuả guanine 1.6 Vài nét về cây Cỏ sữa l to (Euphorbia hirta L. ) 1.6.1 Mô tá Cỏ sữa l to (Euphorbia hỉrta L. ) l cây thảo, sống hàng năm hay sống dai, có... cây con thường mọc thành đám ở khu vực trước có cây mẹ [ 18] 3 1 CHƯƠNG 2 ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Mầu thực vật + Cây Cỏ sữa l to + Bộ phận sử dụng: to n thân của cây cỏ sữa l to + Địa điểm thu mẫu: Dược Thượng-Tiên Dược- Sóc Sơn-Hà Nội sấy khô ở 60°c sau đó được ngâm kiệt trong Ethanol 90 thu dịch cao phục vụ cho các bước nghiên cứu Hình 2.1 Cây Cỏ sữa l . .. Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cún Từ 3000g cỏ sữa l to (Euphorbia hỉrta L. ) rửa sạch, sấy khô được ngâm chiết với ethanol 90% Quá trình ngâm chiết được tiến hành l p l i 3 l n Phần nước l c được l c qua giấy l c 3 l n để loại bỏ cặn thu được dịch chiết Cô cạn dịch chiết thô bằng máy cô quay chân không thu được cao tổng số Cao tổng số sau khi hoà tan l i trong nước cất được chiết qua các loại dung môi... 500mg /l acid gallic Cho vào mỗi cuvert 20 ịiì mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn ) + 1.58 ml H20 + 1 00jll1 thuốc thử FolinCiocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 ỊLil Na 2C03 Để hỗn họp dunh dịch phản ứng trong hai giờ ở 20°c rồi xác định ở bước sóng 765 nm Tiến hành định l ợng acid gallic để dựng đường chuẩn Định l ợng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng... trên đặc điểm tăng nồng độ lipid và lipoprotein máu Trên thực hành l m sàng, phân loại rối loạn lipid máu dựa trên những 2 1 rối loạn tiền phát hoặc thứ phát và tính chất tăng lipid máu, ví dụ tăng cholesterol đơn thuần, tăng triglycerid đơn độc hay tăng cả cholesterol và triglycerid (tăng lipid máu hỗn hợp) Phân loại này có bất cập l không tính đến các bất thường của lipoprotein (ví dụ giảm HDL hoặc... số lipid máu Các số liệu được thu thập và tiến hành xử l thống kê 2.2.4 Sắc ký l p mỏng Sắc ký l p mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Aflolien60 F245 (Merck) RP18F245 (Merck) bằng hệ dung môi Toluen:Ethylaxetat:Aceton:Acid Formic(TEAF) 5:3:1:1 Dùng chất hiện màu l H2S04 10%,sấy kho trên bếp điện từ đến khi hiện màu 2.2.5 Nghiên cún tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây cỏ sữa l to. .. HDL-cholesterol (HDL-c) và LDL- 2 2 cholesterol (LDL-c) 1.3 Bệnh đái tháo đường 1.3.1 Khái niệm và phân loại 1.3.1.1 Khái niệm Theo WHO, ĐTĐ l một hội chứng rối loạn chuyến hóa cacbohydrat có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn to n insulin hoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin ĐTĐ l một nhóm các bệnh chuyên hóa có đặc diêm l tăng... Định l ợng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin Ciocalteau Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các họp chất polyphenol (trong mẫu) vói thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam So màu trên máy quang phổ uv VIS 1000 ở bước sóng X = 765 nm, dùng chất chuẩn l acid gallic [35] Các bước tiến hành như sau: * Chuẩn bị mẫu định l ợng và hóa chất Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + lOml... + 90ml H20 bảo quản 3 5 l nh Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic có nồng độ 5mg/ml Dung dịch Na2C03; 200g Na2C03 + 800ml H20 đun sôi Thêm một vài giọt tinh thể Na2C03, sau 24 giờ đem l c và dẫn nước cất tới lOOOml Dung dịch mẫu cần định l ợng * Tiến hành xây dụng đường chuẩn acid gallic Chuẩn bị cốc định l ợng theo số l ợng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2, 3, 5 và lOml sau đó dẫn nước cất tới lOOml ta . Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây cỏ sữa l to cEuphorbia hirta L. )”. 2. Mục đích nghiên cứu - Đánh giá hoạt tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết tù’ cây Cỏ sữa. tính, định l ợng họp chất thứ sinh trong một số phân đoạn dịch chiết tù’ cây Cỏ sữa l to ( Euphorbia hỉrta L. ) - Nghiên cứu đặc tính hóa sinh của một số phân đoạn dịch chiết. - Nghiên cứu tác động. 18-20g), do viện vệ sinh dịch tễ TW cung cấp. 4.2. Phạm vi nghiên cún Nghiên cứu đặc tính sinh dược của một số phân đoạn dich chiết từ cây Cỏ sữa l to ( Euphorbia hirta L. ) trên mô hình chuột