MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu chung về rƣợu vang 3 1.1.1 Vài nét về rượu vang 3 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang 4 1.2 Vi khuẩn lactic 7 1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang 10 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni 11 1.3 Quá trình lên men malolactic 12 1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic 12 1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic 14 1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất lượng rượu vang 15 1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic 18 1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic 18 1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic 19 1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong sản xuất vang 20 1.5 Các phƣơng pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lƣợng rƣợu vang 21 CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất 25 2.1.1 Nguyên liệu 25 2.1.2 Vi sinh vật 25 2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật 25 2.1.4 Hóa chất 26 2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp công nghệ 26 2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 27 2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa 28 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu vang 31 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận 31 3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập 33 3.1.3 Xác định khả năng chịu SO 2 của 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được 36 3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12 trên môi trƣờng rƣợu vang non 37 3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic 42 3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ƣu quá trình lên men malolactic O.oeni NT12 44 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên men malolactic. 44 3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic 47 3.4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang . 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân tích rượu vang đỏ trước và sau lên men malolactic 15 Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được 31 Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập được 34 Bảng 3.3 Khả năng lên men malolactic của 8 chủng vi khuẩn phân lập được 35 Bảng 3.4 Hàm lượng axít malic và axít lactic trước và sau lên men Malolactic trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm lượng K 2 S 2 O 5. bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v 37 Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 38 Bảng 3.6 Hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 39 Bảng 3.7 Hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 40 Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 41 Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 02 chủng 43 Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi lên men rượu 45 Bảng 3.11 Hàm lượng axít malic (g/l) được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác nhau theo thời gian 46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic trong quá trình lên men malolactic 48 Bảng 3.13 Thành phần của rượu vang sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic 49 Bảng 3.14 Thời gian lên men và hàm lượng axít malic, axít lactic sau quá trình lên men malolactic ở các thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác nhau 51 Bảng 3.15 Rượu etanol được tạo thành và hàm lượng đường sót sau quá trình lên men malolactic 52 Bảng 3.16 Sự tạo thành 1 số chất bay hơi được tạo thành sau quá trình lên men malolactic 53 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng chuỗi của chủng O.oeni. 10 Hình 1.2. Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình 13 Hình 1.3. Cơ chế của quá trình lên men malolactic 133 Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic 17 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho . 27 Hình 3.1 So sánh hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 38 Hình 3.2. So sánh hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 39 Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 41 Hình 3.4 So sánh hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 42 Hình 3.5 So sánh hàm lượng axit axetic tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng 43 Hình 3.6 Hàm lượng axít malic được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác nhau theo thời gian. 46 Hình 3.7 So sánh sự tạo thành rượu etanol sau quá trình lên men malolactic 52 Hình 3.8 So sánh sự tạo thành 1 số chất bay hơi sau quá trình lên men malolactic . 53 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AG Acid Grape - Nước nho axít CoA Coenzyme A CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc HDL High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao LAB Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic MRS De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS NAD + Nicotinamit Adenin Dinucleotide NADH Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen EO Chế phẩm Essential oenos OD Optical density - Mật độ quang MLF Melolactic fermentaeion - Lên men malolactic 1 MỞ ĐẦU Rượu vang là đồ uống có cồn được sản xuất từ quá trình lên men dịch quả nói chung mà phổ biến nhất là từ quả nho. Do nho là loại quả có thành phần hoá học thích hợp cho nấm men phát triển và có hương thơm đáp ứng được những yêu cầu cho sản xuất rượu vang chất lượng cao. Trải qua lịch sử hình thành và phát triển lâu đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v là đồ uống có lợi cho sức khỏe của con người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon rất được ưa chuộng ở khắp nơi trên thế giới. Từ nhiều năm nay, rượu vang nho đã trở thành thức uống phổ biến ở nước ta. Thị trường rượu vang trong nước rất phát triển, tuy nhiên vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu cả về chất và lượng. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập khẩu đã tăng khoảng 25%/ năm. Trong đó, Ninh Thuận được biết đến là vùng trồng nho chính có sản lượng lớn nhất cả nước, hiện trồng chủ yếu là giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi hơn là để lên men rượu vì cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn. Do vậy, chất lượng rượu vang Việt Nam hiện nay chưa thật cao khi so sánh với rượu vang nhập khẩu do hương và vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị lắng cặn…Với tiềm năng về thị trường lớn như ở nước ta, việc cải tiến công nghệ để sản xuất rượu vang nho là vấn đề đang rất được quan tâm. Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất rượu vang nho đi sâu làm rõ các cơ chế như: sự chuyển hóa các thành phần trong nho thành các chất thơm trong rượu vang, tác động của điều kiện môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong quá trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu vang là quá trình lên men thực hiện chủ yếu nhờ nấm men và một phần bởi vi khuẩn lactic có mặt trên quả nho hoặc trên thiết bị làm rượu. Nấm men sử dụng hệ enzym của mình để chuyển hóa glucoza và một số đường khác thành rượu và các sản phẩm phụ khác (rượu bậc cao, este, các axít hữu cơ ), trong khi đó vi khuẩn lactic chuyển hóa axít malic thành axít lactic và CO 2 bằng quá trình lên men malolactic. Lên men malolactic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất rượu vang đỏ và 1 số loại vang 2 trắng, đây là một quá trình không thể thiếu trong việc làm biến đổi các thành phần hóa học, mang lại cho rượu vang những hương vị đặc trưng. Với điều kiện, công nghệ sản xuất rượu vang của Việt Nam hiện nay, việc phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa quá trình lên men malolactic là rất cần thiết. Điều này đã giúp các nhà sản xuất rượu vang kiểm soát quá trình sản xuất rượu vang được tốt hơn, giảm rủi ro tạo ra các sản phẩm hỏng hoặc có chất lượng không ổn định, đồng thời làm đa dạng các chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng. Từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho công nghệ sản xuất rượu vang nho chất lượng cao của Việt Nam giải quyết những vấn đề thực tiễn của ngành sản xuất rượu vang trong nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang”. 3 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về rƣợu vang 1.1.1 Vài nét về rượu vang Rượu vang là thức uống có cồn được sản xuất bằng phương pháp lên men không chưng cất từ dịch nho. Nhờ tác nhân lên men (lên men một giai đoạn) hoặc nhờ nấm men và vi khuẩn lactic (lên men hai gian đoạn) đã tạo cho rượu vang có hương vị đặc trưng, cũng như giá trị dinh dưỡng cao hơn hẳn các loại rượu khác. Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng la tinh là “vinum”, được bắt nguồn từ chữ “vinea”, có nghĩa là cây nho. Trước tiên việc sản xuất rượu vang được tiến hành bằng cách ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự nhiên trong các hang đá. Người La Mã có công truyền bá nghề trồng nho làm rượu sang Pháp Marseilles từ thế kỉ II, sau đó là vùng Champagne và Monselle Valley vào khoảng thế kỉ IV. Pháp bắt đầu xuất khẩu rượu vang sang Anh và Đức vào thế kỉ XII. Vào năm 1857, lần đầu tiên trong lịch sử, Louis Pasteur công bố những nghiên cứu về quá trình lên men, xác định rõ vai trò quan trọng của nấm men trong quá trình lên men rượu và sự biến đổi hoá sinh trong quá trình lên men của nấm men [8]. Đến nay đã có hàng trăm loại rượu vang khác nhau đáp ứng được nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng. Phân loại rượu vang được dựa trên màu sắc: vang màu và vang trắng, trong các loại vang màu thì rượu vang đỏ có giá trị cao nhất. Ngày nay nguyên liệu chế biến rượu vang được mở rộng ra các loại nguyên liệu quả khác nhau, phong phú về màu sắc và chất lượng. Trải qua nhiều thế kỷ, rượu vang đã khẳng định vai trò của nó với sức khỏe con người. Louis Pasteur đã nhiều lần khẳng định: “Rượu vang là loại đồ uống rất vệ sinh và rất có lợi cho sức khoẻ”. Khoa học hiện nay đã phát hiện trong rượu vang đỏ có chứa chất trans-resveratrol là một chất chống oxi hóa, gặp trong vỏ của quả nho đỏ (vỏ mỗi quả chứa khoảng 2µg trans-resveratrol). Các polyphenol trong Chất này có tác dụng trung hòa các tác nhân oxi hóa, chẳng hạn các gốc tự do được tạo thành trong quá trình trao đổi chất bình thường của tế bào. Các gốc tự do này sẽ gây hư hại mô nếu không nhanh chóng được loại bỏ. Chính tác dụng nói trên của 4 trans-resveratrol đã góp phần làm giảm nguy cơ tử vong do bệnh nhồi máu cơ tim ở người [30]. 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12] Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia các kiểu lên men khác nhau. Có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường thành ethanol và CO 2 . Thực chất đây là quá trình oxi hoá - khử có mặt các enzyme của nấm men. Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của nấm men hoặc bị tiêu hao dưới dạng nhiệt [7]. Sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình lên men có thể dẫn tới sốc nhiệt làm ảnh hưởng tới hoạt tính của nấm men. Do vậy giữ nhiệt độ ổn định trong quá trình lên men là một yếu tố quan trọng giúp quá trình lên men được hoàn thành. Nấm men nhạy cảm nhất với nhiệt độ trong giai đoạn đầu phát triển và nhân lên và nó trở nên chống chịu tốt hơn trong giai đoạn sau. Do vậy đối với lên men rượu vang thì giai đoạn đầu của quá trình lên men nên duy trì ở nhiệt độ 18-22 o C và sau đấy cho phép tăng dần lên [7, 12]. Nhiệt độ lên men ban đầu quá cao có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng ì ở cuối quá trình lên men. Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: - Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối. - Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO 2 : giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO 2 . Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp. Ngoài ethanol còn nhiều chất khác như este, rượu bậc cao, các axit hữu cơ, glycerol, dầu fusel Tỷ lệ các sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều kiện của môi trường lên men. 5 Trong quá trình này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu và giải phóng CO 2 dưới tác dụng xúc tác của enzyme do nấm men tạo ra theo con đường Enol- pyruvat [7]. Nho đỏ Nghiền/chà tách cuống Sulfite hóa Ngâm Tách dịch nho rỉ Tách cặn Hiệu chỉnh thành phần dich nho Lên men Lên malolactic Ủ rượu Ổn định rượu Làm trong Rót sản phẩm Rượu Vang Hho Cặn Cặn Cuống SO 2 Nấm men Hoạt hóa nấm men Vi khuẩn lactic [...]... men malolactic, hương và vị của rượu đầy đủ hơn nhưng lại thanh hơn [7] 1.3.3.4 Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên menmalolactic Thành phần rượu vang, phương pháp sản xuất và mối tương tác giữa vi khuẩn malolactic và các vi sinh vật khác có thế ảnh hưởng tới sự sống sót và sinh trưởng củavi khuấn malolactic trong rượu vang và vì vậy ảnh hưởng tới quá trình lên menmalolactic... L-malic, L-lactic và axít axetic bằng phương pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức) 30 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu vang 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận Các vi khuẩn có khả năng phân giải axít malic trong rượu vang được gọi là vi khuẩn malolactic Để phân lập được các chủng malolactic này, trước... Lactobacillus casei và Lactobacillus plantarum có các enzym của cả hai con đường (đường phân và pentoza-photphat) và chúng thích nghi với một trong hai con đường này phụ thuộc vào điều kiện môi trường [14] 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni Mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng trong sản xuất rượu vang nhưng O oeni vẫn là loài vi khuẩn được lựa chọn bởi đa số các nhà sản xuất rượu vang O oeni có... 5-10% so với rượu ngoại tương ứng và gây tiêu tốn ngoại tệ cho vi c nhập khuẩn rượu [7] 21 Sản xuất vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát trong suốt quá trình bảo quản vang non trong thời gian vài tháng hoặc nhiều năm Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc ở thùng gỗ Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất vang hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm... đoạn nóng và ít mưa kéo dài, thì các vi khuẩn lactic sẽ xuất hiện nhiều hơn trên bề mặt quả nho Tuy nhiên, các loài vi sinh vật ban đầu này xuất hiện rất ít trong rượu vang mà phần lớn là các loại vi khuẩn nhiễm tạp từ các dụng cụ làm rượu trong các giai đoạn khác nhau diễn ra trong quá trình bơm dịch nước nho vào thùng lên men Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong các loại rượu vang một số vi khuẩn tự... axít và hàm lượng cồn cao trong rượu Rượu vang cấy các chủng O oeni đã tuyển chọn cho phép dễ dàng kiểm soát toàn bộ quá trình lên men malolactic Ngoài ra, vi c lựa chọn một chủng o oeni có thể cho phép các nhà sản xuất rượu đảm bảo về các tính chất được tạo ra trong sản phẩm cuối cùng Do vậy, rượu vang tạo ra đặc trưng Mặc dù, thường chỉ một chủng vi khuẩn được lựa chọn, nhưng trong một số trường hợp... vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4 tái tổ hợp Thành công này cho phép nghĩ tới vi c ứng dụng các chủng nấm men tái tổ hợp trong tương lai, khi chúng hội tụ đầy đủ các tính chất cần có của một chủng nấm men công nghiệp và đồng thời có hoạt tính lên men malolactic mạnh [43] 1.5 Các phƣơng pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lƣợng rƣợu vang Rượu vang mới chỉ xuất. .. của rượu vang 1.3.3.2 Những thay đổi về hương Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn malolactic khác nhau có thể tăng hoặc giảm cường độ của các đặc tính hương và vị của rượu vang và những thay đổi này phụ thuộc vào chủng vi khuẩn Ngoài ra, hương rượu vang chịu tác động của lên men malolactic có thể là mùi bơ, mùi hạt dẻ, mùi nấm men, mùi gỗ 15 sồi, mùi mồ hôi và mùi đất Lên men malolactic. .. kiện thuận lợi cho các vi khuẩn Đây là tác nhân quyết định chính tới số lượng của quần thể các vi khuẩn và đối với sự phát triển của chúng trong giai đoạn đầu của quá trình lên men Trong quá trình sản xuất rượu vang, có lên men malolactic, quần thể vi khuẩn tự nhiên pháp triển trải qua rất nhiều pha khác nhau Trong những ngày đầu tiên của quá trình lên men rượu, các loại vi khuẩn và nấm men tự phát triển... trưởng của các vi khuẩn malolactic [7] 1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic 1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic Với mục đích khắc phục một cách hiệu quả các yếu tố bất lợi nói trên người ta đã sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả năng lên men malolactic mạnh trong quá trình sản suất rượu vang Để sử dụng các chế phấm này một cách hiệu 18 quả, các nhà sản xuất khuyến . thực tiễn của ngành sản xuất rượu vang trong nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang . 3 CHƢƠNG. rƣợu vang 3 1.1.1 Vài nét về rượu vang 3 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang 4 1.2 Vi khuẩn lactic 7 1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang 10 1.2.2 Vi khuẩn. 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni Mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng trong sản xuất rượu vang nhưng O. oeni vẫn là loài vi khuẩn được lựa chọn bởi đa số các nhà sản xuất rượu vang.