I HC QUC GIA HÀ NI I HC KHOA HC T NHIÊN Phng NHÂN DÒNG VÀ BIU HIN TRÊN B MT BÀO T BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CA VIRUS GÂY BM TRNG  TÔM Chuyên ngành: Hóa sinh hc Mã s: 62 42 01 16 D THO TÓM TT LUN ÁN TIC HÀ NI - 2014 2 c hoàn thành ti: i hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà Ni ng dn khoa hc: GS.TS. Phan Tu PGS.TS. Nguyn Th Vân Anh Phn bin 1: Phn bin 2: Phn bin 3: Lun án s c bo v ti Hng chm lun án ci hc Quc gia hp ti: i hc Khoa hc T nhiên vào hi gi5 Có th tìm hiu lun án ti: - n Quc gia Vit Nam, - Trung tâm thông tin - i hc Quc gia Hà Ni 1 M U 1. Tính cp thit c tài Nuôi tôm  Vin mnh trong nh và tr thành ngành kinh t quan trng. Tuy nhiên, ngành nuôi trng tôm  Vit Nam hi   c nhi    ch bnh, cht ng tôm ging sa sút. S bùng n ca các dch bnh nghiêm trng do virus (WSSV), m  sng tôm, gây thit hi ln v kinh t. Nhiu nghiên cu trên th gic ti tìm ra gii pháp hiu qu chng l   t qu  c còn hn ch. Mt ng nghiên cc nhiu nhà khoa hc trên th gin là to các vaccine da trên protein cu trúc c ng min dch  tôm chng li bm trng. VP28 là mt loi protein v chính ca WSSV,  o giúp virus gc hiu lên t bào c khu cho quá trình lây nhim. Chính vì vy, VP28 là c la ch to kháng th cho vaccine cho tôm phòng b m trng (Rout và tp th, 2007; Witteveldt và tp th, 2004). Tuy nhiên, nhng kt qu nghiên cu to vaccine phòng bm trng do WSSV  mi dng li  mc th nghim nh lc mt vaccine chính thc, hiu qu. i “Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” bào t Bacillus subtilis biu hin kháng nguyên VP28 ca virus gây bm trng làm  cho vic sn xut vaccine dng probiotic bn nhit giúp phòng bm trng trên tôm. 2 2. Mc tiêu nghiên cu c tài - nh c trình t và mt s a gen VP28 t các mu WSSV phân lc  a bàn nuôi tôm ch yu ca Vit Nam. - T c chng Bacillus subtilis tái t hp biu hin gen mã hóa protein kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t. - c kh m trng trên tôm th chân trng ca ch phm bào t B. subtilis biu hin VP28 trên b mt. ng và ni dung nghiên cu c tài ng nghiên cu c tài: Gen mã hóa protein VP28 ca virus gây bm trng  tôm. Ni dung nghiên cu c tài: - nh trình t và mt s a gen vp28 t các mu WSSV phân lc  Vit Nam. - Xây dng quy trình biu hin gen mã hóa cho VP28 trên b mt bào t Bacillus subtilis. - Nghiên cu th nghim kh m trng trên tôm th chân tr  n bào t Bacillus subtilis biu hin VP28. m thc hi tài Các nghiên cu ca luc thc hin ch yu ti Phòng Thí nghim trm Công ngh i hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà Ni. Phn th nghim kh o h tôm th chân trng phòng bnh m trc thc hin vi s h tr, hp tác ca Vin Nghiên cu nuôi trng Thy sn I. 3 i c tài - Công trình nghiên cu có tính h thng t vic nhân bn, nhân dòng và biu hin gen mã hóa protein VP28 tái t hp  E. coli và Bacillus subtilis nh trình t và mt s a gen VP28 t các mu WSSV phân lc  Vit Nam. - Nghiên cu biu hin thành công gen mã hóa protein VP28 ca WSSV trên b mt bào t B. subtilis i dng các cu trúc protein dung hp CotB-VP28 và CotB-GST-, CotB là protein v ca B. subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhm hn ch cn tr i vi VP28. - tu kin thu nhn bào t tái t hp B. subtilis biu hin tt kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t và nghiên cu các tính cht ca bào t tái t hp B. subtilis CotB-VP28, CotB-GST- VP28 trong mt s u king khác nhau. - c ho ca các enzyme phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD) phn ánh min dch ca tôm th m trng trên tôm 70% ca bào t B. subtilis biu hin VP28 trên b mt. 6. ng dng thc tin c tài - Kt qu nghiên cu c   to ch phm probiotic dng bào t B. subtilis tái t hp bn nhit, biu hin VP28 trên bn mt, có kh ng min dch và bo v tôm khi nhim bm trng, giúp góp phn kim soát dch bnh trên tôm. - Thành công c tài s là ti cho vic phát trin các vaccine tái t hp dng bào t B. subtilis tái t hp có kh nh do các vi sinh vt khác gây ra  tôm. 4 7. B cc ca lun án Lun án gm 120 trang bao gm: Phn m u (3 trang); Tng quan tài liu (40 trang); u (19 trang); Kt qu và tho lun (39 trang); Kt lun và kin ngh (1 trang), Các công trình khoa hc ca tác gi n lun án (1 trang), Tài liu tham kho (16 trang122 tài liu gm 2 th ting ting Vit () và ting Anh (). Lun án có 15 bng, 43 hình. 5 NG QUAN TÀI LIU 1.1. Gii thiu chung v virus gây bm trng  tôm Virus gây bm trng (White Spot Syndrome Virus   ) thuc h Nimaviridae và chi Whispovirus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV/). VP28,  mã hóa    (ORF) 421 bp (wsv421), là mt protein v quan trng, t quan trng trong nhu tiên ca quá trình nhim WSSV vào tôm (Van Hulten và tp th, 2001). i pháp hiu qu  ngn nga s tn công ca loi virus này  tôm. 1.2. Nghiên cu to vaccine da trên kháng nguyên v WSSV Tôm thu     min dch , t s nghiên cu gy có kh c hic kích thích bi các dng kháng nguyên VP28.  protein VP28 . c biu hin thành công  E. coli (Zhang và tp th, 2002; Sathish và tp th, 2004; Witteveldt và tp th 2004; Jha và tp th, 2005; Caipang và tp th, 2008; Hou và tp th, 2011; Syed-Musthaq và tp th, 2011; Mu và tp th, 2012). S dng VP28 là mt bi ng sót ci vi WSSV. , y có là khó áp dng trên thc t do protein VP28 không bn vng nc cho trc tim nuôi tôm   sn xut cao.  nghiên cu tp trung vào vic phát trin các dng vaccine vi khun sng tái t hp biu hin VP28.  cho thy rng các loi bào t tái t hp VP28 giúp bo v  l 6 sng ca tôm khi th nghim vi WSSV so vc dùng bào t tái t hp VP28 (Fu và tp th, 2010; Ning và tp th, 2011). Tuy vy các kt qu nghiên cu mi ch      t loi vaccine chính thc to ra. Vì vy vic tip tc nghiên c tc vaccine phòng bm trng là ht sc cn thit. 7 NG, NGUYÊN LIU VÀ U ng và nguyên liu 2.1.1. Đối tượng 23 mu tôm có biu hin nhim WSSV c thu thp t các m nuôi tôm ti các   c nhau (Hi Phòng; Hu; Khánh Hòa; Thành ph H Chí Minh; ; Ninh Thun; Bn Tre; nh, Kiên Giang; Trà Vinh), c bo qun  -80 o C hoc trong cn 95 o C. Tôm th chân trng (2-5g/con) dùng trong th nghim th thách kh o h phòng nga WSSV c Phân viên nghiên cu nuôi trng Thy sn Bc Trung b thuc Vin nghiên cu nuôi trng thy sn 1. 2.1.2. Nguyên liệu Chng vi khun B. subtilis PY79 và vector pDG364, pDG364-CotB; pDG364-CotB-GST là quà tng ca GS. Simon Cutting, i hc Hoàng gia Holloway, London, Anh. Các chng vi khun E. coli  E. coli   c mua t hãng Novagen. Vector pET28b ca hãng Novagen (M); các oligonucleotide ca hãng Life Technology, kit nhân dòng trc tip sn phm PCR pGEM TA easy và   c mua t hãng Promega; thang chun protein, thang chun DNA 1kb và 100 bp, hn hp  c mua t hãng Fermentas; Hot-   c mua t hãng Enzynomics; kit thôi gel c mua t Bioneer; MagPure viral DNA/RNc mua t ANABIO R&D; Qiaprep-miniprep c mua cc mua t hãng Biobasic. Các cp m c thit k c hi   n gen mã hóa cho VP28 ca virus gây bm trng WSSV, cotB; cp mc hiu cho v 8 trí amyE front, amyE back ca vector pDG 364, cp mi ca vector pGEM T và cp mi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv ca hãng Life Technology. u 2.2.1. Thu nhn virus gây bm trng t mu tôm nhim bnh 2.2              -time PCR 2.2.3. Nuôi cy to bào t B. subtilis  Nicholson và Setlow (1990) 2.2.4. Tách chit, ANABIO R&D, ng DNA 260 nm 2.2.5. vp28 2.2.6. ng (1976) và tinh sch proteinVP28t Hisbind 2.2 (SDS-PGAGE) theo Laemmli (1970) 2.2        -     2.2.9. Th nghim kh m trng ca bào t B. subtilis tái t hp            , superoxide dismutase. [...]... 5x109 bào tử CotB -VP28 và CotB-GST -VP28 vào khoảng 225 ng, căn ứ vào KLPT của VP28 (27,5 kDa), có thể tính toán đượ rằng ó khoảng 1000 phân tử VP28 tái tổ hợp đượ biểu hiện trên một bà tử B subtilis Kết quả này, bướ đầu khẳng định bào tử B subtilis của 2 chủng tái tổ hợp đã biểu hiện protein dung hợp CotB -VP28, CotB-GST -VP28 ết quả kiểm tra khả năng biểu hiện protein VP28 và GST -VP28 trên bề mặt bào tử. .. CotB-GST -VP28 Một số khuẩn lạc của 2 chủng tái tổ hợp CotB -VP28 và CotB-GST -VP28 được chọn nuôi, tạo bào tử để kiểm tra sự biểu hiện của VP28 So sánh bào tử của chủng chuẩn B subtilis PY79 với bào tử của chủng CotB -VP28 và CotB-GST -VP28, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về mặt hình thái Bào tử tạo thành bởi 3 chủng đều đạt hơn 95 Với mụ đí h xá định VP28 có biểu hiện trên lớp áo của bào tử và dung... ông trên bề mặt bào tử B subtilis Hình 3.14: Ảnh chụp ết u ph n tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu hiện CotB -VP28 và cotB-GST -VP28 trên bề mặt bào tử B subtilis Ning và tập thể (2011) đã biểu hiện protein VP28 trên bề mặt của bào tử B subtilis sử dụng một đ ạn DNA 825 bp mã hóa cho 275 acid amin đầu tiên của CotB làm yếu tố dung hợp Mặc dù, mứ độ biểu hiện của protein VP28 tr ng nghiên ứu ủa... amin 2 Đã biểu hiện thành công gen mã hóa VP28 ở E coli dưới dạng VP28- His-tag và tạ được chế phẩm bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp với sự biểu hiện VP28, GST -VP28 trên bề mặt bào tử dưới dạng dung hợp với CotB của B subtilis 3 Bào tử tái tổ hợp B subtilis cotB -VP28 và cotB-GST -VP28 được tạo thành tối ưu tr ng môi trường DSM sau 48 giờ và đạt mật độ tương ứng là 3,1 x 109, 4,2 x 109, bền ở nhiệt độ... qu SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra sự biểu hiện VP28 trên bào tử B subtilis 16 (+ : Đối chứng dương, pr tein VP28 tinh ạch M: Thang chuẩn protein 1: Bào tử B subtilis cotB -vp28 biểu hiện protein CotB -VP28 2: Bào tử B subtilis PY79 chủng chuẩn 3: Bào tử B subtilis cotB-GSTvp28 biểu hiện CotB-GST -VP28 Kết quả SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (hình 3.13) cho thấy ó sự xuất hiện băng pr tein... rằng húng tôi đã nhân bản thành ông đ ạn gen mã hóa cho VP28 từ DNA hệ gen của tôm nhiễm viru đốm tr ng 3.1.2 Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28 Đ ạn gen nhân bản bằng PCR ủa á mẫu nghiên ứu đã đượ nhân dòng vào ve t r p E T tạ ra dạng ve t r tái tổ hợp p E -VP28 và au 9 đó á gen vp28 tr ng ve t r tái tổ hợp đã đượ xá định trình tự hi ánh trình nu le tide và trình tự a id... vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 và rất cần được quan tâm trong các nghiên cứu tiếp theo 3 trong số 23 trình tự gen vp28 có những khác biệt đáng lưu với các ký hiệu 05VN .VP28. HCM2.12, 0 VN .VP28. BD2.12 đã đượ đăng k trên 06VN .VP28. BD1.11, enBank với các mã số (accession number) tương ứng là JX444992.1, JX444993.1 và JX444994.1 3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28 3.2.1 Biểu hiện P28 b ng hệ... có khả năng giúp tôm kháng lại sự tấn công của viru đốm tr ng Các chủng CotB -VP28, CotB-GST -VP28 được lấy ra và nuôi cấy tạo bào tử và nghiên cứu một số tính chất của bào tử cho thấy bào tử tái tổ hợp B subtilis cotB -VP28 và cotB-GST -VP28 được tạo thành tối ưu tr ng môi 18 trường DSM sau 48 giờ và đạt mật độ tương ứng là 3,1 x 109, 4,2 x 109, bền ở nhiệt độ 80oC, nồng độ muối 4% và chịu được pH trong... đượ lựa họn để biểu hiện VP28 trên bề mặt bà tử B subtilis Trong ve t r tái tổ hợp pDG364cotB -VP28, pDG364cotB-GST -VP28 tạ đượ đã ba gồm những vùng pr m ter tB (P tB và đ ạn gen ó kí h thướ 825 bp, 1325 bp tương ứng mã hóa h CotB ải biến và C tB ó g n ST Đ ạn gen vp28 đượ nhân lên từ p E -VP28 bằng PCR ử dụng ặp mồi VP28. 3 Fw và VP28. 3 Rv có hứa trình tự ủa HindIII ở đầu Fw và EcoRI ở đầu Rv để thuận... PCR, với cặp mồi của vp28 và của vector pDG364 ết quả phân tí h PCR, đọc trình tự cho thấy gen mã hóa VP28 đã đượ đưa vào vector pDG364-cotB và pDG364-cotB- ST đúng trình tự và vị trí khung đọ Như vậy, ó thể kết 14 luận rằng húng tôi đã tạo thành công vector tái tổ hợp pDG364-cotBvp28 và pDG364-cotB-GST -vp28 Để dung hợp đ ạn gen cotB -vp28, cotB-GST -vp28 vào hệ gen của B subtilis PY79 dựa trên ơ hế tra . Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm”  bào t Bacillus subtilis biu hin kháng nguyên. Phng NHÂN DÒNG VÀ BIU HIN TRÊN B MT BÀO T BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CA VIRUS GÂY BM TRNG  TÔM Chuyên ngành: Hóa sinh hc Mã s: 62 42 01. vi VP28. - tu kin thu nhn bào t tái t hp B. subtilis biu hin tt kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t và nghiên cu các tính cht ca bào t tái t hp B. subtilis