BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== CỒ THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ MAI HƢƠNG PGS.TS. TRẦN LIÊN HÀ Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Thành Đạt Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Trung Thành Phản biện 3: PGS.TS. Phạm Quang Thu Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp trƣờng; Họp tại: Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội; Vào hồi:…… giờ, ngày……, tháng……, năm…… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 2. Thư Viện Quốc gia Việt Nam 1 I. Giới thiệu 1. Đặt vấn đề Nấm lớn có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống, chúng có vai trò trong nền kinh tế, khoa học và tham gia vào các chu trình chuyển hóa vật chất - năng lượng trong tự nhiên. Nhiều loài nấm lớn được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị loãng xương… Trên thế giới có khoảng hơn 2000 loại nấm có thể ăn và dùng làm thuốc, ngoài nguồn nấm thu hái từ thiên nhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao. Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng của con người trong tương lai. Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế thải từ nông, lâm nghiệp (rơm, rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô…) rất dồi dào, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; bên cạnh đó điều kiện tự nhiên (nhiệt độ, độ ẩm…) của nước ta rất phù hợp với việc nuôi trồng nấm. Trong mười năm trở lại đây ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu ở Việt Nam đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn so với các nước trên thế giới do ít đầu tư vào nghiên cứu các công nghệ tiên tiến, thiết bị hiện đại để áp dụng vào sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu. Công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm vì giống nấm dạng dịch thể so với giống trên cơ chất tổng hợp dạng rắn (mùn cưa, thóc, que sắn…) có rất nhiều ưu điểm vượt trội như: + Chu kỳ phát triển của giống nấm nhanh, qua đó rút ngắn được thời gian nhân giống các cấp (trong điều kiện thuận lợi thì nuôi sợi trong môi trường lỏng khoảng 3 - 5 ngày là có thể sử dụng được, khi cấy sang nguyên liệu nuôi trồng có thể rút ngắn được 1/2 đến 2/3 thời gian ươm sợi); + Tuổi giống đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định; + Sinh lực giống khỏe, khi cấy giống vào giá thể nuôi trồng sợi nấm khôi phục nhanh, khả năng hấp thụ dinh dưỡng và tốc độ lan sợi mạnh; + Giá thành sản xuất giống thấp do quá trình sản xuất tiết kiệm được nguyên nhiên vật liệu, nhân công Ngoài ra, phương pháp này còn thuận lợi trong việc sản xuất nấm trên qui mô công nghiệp. 2. Đối tƣợng nghiên cứu và mục tiêu của Luận án Đối tượng nghiên cứu của luận án là nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers., đây là một loại nấm quí có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, được sử dụng để điều trị hiệu quả một số bệnh ung thư, thậm chí với cả những trường hợp đã dùng hoá trị liệu mà không có tác dụng; Loại nấm này cũng được biết đến thông qua các thử nghiệm về bệnh tim được triển khai rộng và thu được kết quả tốt qua theo dõi trên điện tâm đồ và các triệu chứng lâm sàng; Với các lợi ích lớn về giá trị dinh dưỡng, dược liệu và kinh tế mà loại nấm này mang lại, hiện nay các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới đang rất quan tâm nghiên cứu nhằm hoàn thiện qui trình nhân giống, nuôi trồng, chế biến sau thu hoạch… để tạo ra các sản phẩm phục vụ công tác phòng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe cộng đồng. Mục tiêu của Luận án - Đưa ra được qui trình công nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus; - Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus dạng dịch thể các cấp với dung tích từ 200ml đến 120 lít; - Đưa ra được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể; - Đưa ra được qui trình tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ H. erinaceus thành phẩm, đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất này; 3. Những đóng góp mới của Luận án Công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm không thực sự là công nghệ mới trên thế giới nhưng trong bối cảnh sản xuất nấm tại Việt Nam hiện nay thì đây thực sự là hướng nghiên cứu mới cần được ưu tiên nghiên cứu, phát triển nhằm từng bước thay đổi phương thức sản xuất giống nấm, mang lại hiệu quả kinh tế cao theo hướng sản xuất qui mô công nghiệp, dần dần 2 đưa máy móc vào sản xuất nấm nhằm giảm thiểu lao động nặng nhọc cho người trồng nấm, kích thích người lao động cũng như các doanh nghiệp tham gia sản xuất nấm nhằm tăng sản lượng nấm thương phẩm một cách nhanh chóng, tạo nguồn thu cao và ổn định cho người trồng nấm; Hơn nữa còn tạo ra một khối lượng lớn các sản phẩm nấm phục vụ cho tiêu dùng và cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến, sản xuất thực phẩm chức năng; Vậy những đóng góp mới của Luận án là: - Đã tuyển chọn được chủng nấm Đầu khỉ He1 có khả năng phát triển tốt trong điều kiện nuôi trồng ở Việt Nam; Hoàn thiện phương pháp phân lập lại chủng nấm này để làm cơ sở cho việc bảo quản và sử dụng giống nấm lâu dài; - Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô 120 Lít để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn cơ chất tổng hợp; So sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn; - Đưa ra được qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống dạng dịch thể; - Đã tách chiết và bước đầu khảo sát tác dụng của polysaccharide từ nấm Đầu khỉ bao gồm: hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy invitro, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy trên thạch mềm, kiểm tra độ an toàn và khả năng bảo vệ phóng xạ trên động vật thử nghiệm. 4. Bố cục của Luận án Luận án gồm 147 trang với 58 bảng số liệu, 51 hình ảnh, 73 tài liệu tham khảo; Bố cục của Luận án: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan (28 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (21 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (83 trang); Chương 4: Kết luận (3 trang), Tài liệu tham khảo (6 trang); Danh mục các công trình đã công bố (1 trang). II. Nội dung của Luận án Mở đầu: Đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và mục đích của Luận án Chƣơng 1: Tổng quan Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: - Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam; - Tình hình nghiên cứu tách chiết, chuyển hoá các chất có hoạt tính sinh học trong nấm ăn - nấm dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam; - Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.; Phân loại nấm học; Đặc điểm hình thái quả thể nấm Đầu khỉ; Giá trị dinh dưỡng - dược liệu của nấm Đầu khỉ; Tình hình nghiên cứu về nhân giống, nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và ở Việt Nam. - Một số phương pháp tách chiết polysaccharide trong nấm lớn. Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu Tiếp cận phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật của một số tác giả trong nước và trên thế giới bao gồm: Phương pháp phân lập giống, lên men lỏng nhân giống dạng dịch thể, nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn nguyên liệu tổng hợp, theo các tác giả Nguyễn Lân Dũng, Đinh Xuân Linh, Lê Xuân Thám, S.T. Chang; Phương pháp nấm học trong nghiên cứu hình thái quả thể, bào tử, hệ sợi; theo tác giả Trịnh Tam Kiệt; Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996). Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS(1993). Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm của Abrham W.B.; Turner A.và theo quy định của WHO và Bộ Y tế về an toàn và hiệu lực của chế phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên. 3 Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus 3.1.1. Kết quả tuyển chọn 4 giống nấm Đầu khỉ Ở phần này trình bày chi tiết các kết quả của quá trình nuôi trồng khảo kiểm nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ, mô tả đặc điểm hệ sợi, quả thể, đánh giá khả năng chống chịu sâu bệnh hại, thời gian nuôi trồng của từng giống; Qua quá trình khảo nghiệm tuyển chọn được giống nấm ký hiệu He1 với các đặc tính vượt trội hơn so với 3 giống còn lại như sau: - Khả năng hình thành quả thể đồng loạt, hình thái quả thể đẹp, trọng lượng trung bình cao: đạt 150-170g/ quả, phần thịt nấm chắc, đặc, chất lượng nấm thương phẩm đồng đều. - Thời gian nuôi trồng ngắn: tổng thời gian từ khi cấy giống đến khi thu hái là 56 – 62 ngày. - Có khả năng chống chịu với sâu bệnh hại tốt trong điều kiện nuôi trồng tự nhiên. - Thành phần dinh dưỡng của nấm Đầu khỉ He1 cân đối, so với thành phần dinh dưỡng của nấm Đầu khỉ đã được một số tác giả công bố là tương đương nhau. Kết quả phân tích giá trị dinh dưỡng của chủng Đầu khỉ He1 được ghi nhận ở bảng sau Bảng 3.4: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin của He1 STT Tên chỉ tiêu ĐVT Nấm tƣơi Nấm khô tuyệt đối 1 Hàm lượng nước tổng số % 56,40 - 2 Hàm lượng vật chất khô % 43,60 - 3 Hàm lượng protein thô % 15,6 27,7 4 Hàm lượng Chất béo tổng số % 2,19 5,02 5 Hàm lượng Hydratcacbon % 11,37 26,08 6 Hàm lượng Canxi (Ca) % 0,035 0,08 7 Hàm lượng Phospho (P) % 0,28 0,64 8 Hàm lượng Sắt (Fe) mg/kg 15,99 36,67 9 Hàm lượng Vitamin C mg/100g 8,05 18,46 10 Hàm lượng Vitamin A mg/100g 0,01 0,02 11 Hàm lượng Vitamin B 1 mg/100g 0,30 0,69 Bảng 3.5: Kết quả phân tích thành phần axit amin của nấm Đầu khỉ He1 STT Tên chỉ tiêu ĐVT Kết quả 1 Hàm lượng Aspartic acid mg/g 2,17 2 Hàm lượng Threonine mg/g 1,19 3 Hàm lượng Serine mg/g 0,72 4 Hàm lượng Glutamic acid mg/g 3,66 5 Hàm lượng Proline mg/g 1,02 6 Hàm lượng Glycine mg/g 0,98 7 Hàm lượng Alanine mg/g 1,54 8 Hàm lượng Valine mg/g 1,39 9 Hàm lượng Lysine mg/g 1,35 10 Hàm lượng Methionine mg/g 0,2 11 Hàm lượng Isoleucine mg/g 1,03 12 Hàm lượng Leucine mg/g 1,66 13 Hàm lượng Tyrosine mg/g 0,44 14 Hàm lượng Phenylalanine mg/g 0,78 15 Hàm lượng Histidine mg/g 0,98 16 Hàm lượng Agrinine mg/g 0,92 17 Hàm lượng Cystine mg/g 0,07 Kết luận: lựa chọn giống He1 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trong Luận án. 4 3.1.2. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ. Ở phần này trình bầy các kết quả nhằm xây dựng qui trình phân lập giống nấm Đầu khỉ bao gồm: - Lựa chọn phương pháp phân lập: kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát thực nghiệm cho thấy trong 2 phương pháp phân lập thì nấm Đầu khỉ phù hợp với phương pháp nuôi cấy mô quả thể vì bằng phương pháp nuôi cấy mô hệ sợi có khả năng bung sợi nhanh, sức sống khoẻ, tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy từ bào tử; Xong phương pháp phân lập từ mô nấm lại có nhược điểm là không bảo toàn được các đặc tính di truyền của giống gốc qua nhiều thế hệ nhân chuyển vì vậy để đảm bảo giống không bị thoái hóa, suy biến thì nên lựa chọn sử dụng kết hợp cả hai phương pháp để phân lập lại giống, tùy vào mục đích sử dụng giống. Trong sản xuất, để đáp ứng nhu cầu gấp rút và số lượng lớn, chất lượng giống đồng đều thì nên sử dụng phương pháp phân lập từ mô quả thể; Song song với quá trình sản xuất, để đảm bảo lưu giữ được nguồn giống trong thời gian dài mà không bị suy biến cần tiến hành phân lập giống từ bào tử để bảo quản ở điều kiện lạnh sâu trong thời gian dài. - Xác định thời điểm phân lập: việc lựa chọn đúng thời điểm để phân lập hệ sợi từ quả thể bằng phương pháp nuôi cấy mô có ảnh hưởng lớn đến chất lượng giống nấm. Tốc độ sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ phân lập ở 4 giai đoạn quả thể khác nhau có sự khác biệt rõ rệt cả về đặc điểm giống lẫn chất lượng giống; Ở giai đoạn mầm quả thể và quả thể còn non đưa ra phân lập thì hệ sợi nấm không phát triển, mô nấm bị teo dần; Ở giai đoạn quả thể già, bắt đầu phát tán bào tử đưa ra phân lập thì chất lượng giống kém, sớm xuất hiện quả thể ngay trên môi trường nuôi cấy thuần khiết; Ở giai đoạn quả thể trưởng thành đưa ra phân lập cho chất lượng giống tốt, chậm xuất hiện quả thể, thấy xuất hiện nhiều bào tử phấn trên bề mặt thạch, đây là biểu hiện của giống Đầu khỉ có chất lượng cao. - Xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ + Nguồn cacbon thích hợp: Trong các loại đường bổ sung thì đường glucose là thích hợp, cho tốc độ sinh trưởng của hệ sợi lớn nhất đạt 6,25 mm/ ngày, đồng thời đặc điểm hệ sợi tốt nhất. Việc bổ sung các phụ gia nguồn gốc tự nhiên như cám gạo, bột ngô hoặc mầm malt cũng có tác động tốt đối với sự phát triển của hệ sợi nấm đầu khỉ. Như vậy, nguồn đường thích hợp để bổ sung vào môi trường phân lập giống gốc là đường glucose. + Nguồn nitơ thích hợp: trong các nguồn nitơ sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ thì nguồn nitơ hữu cơ cho tốc độ sinh trưởng của hệ sợi cao hơn so với nguồn nitơ vô cơ. Bổ sung NaNO 3 ; (NH 4 ) 2 SO 4 và NH 4 NO 3 vào nuôi cấy nấm Đầu khỉ cho sinh khối sợi cao hơn không bổ sung nhưng hệ sợi phát triển loang lổ không đều, sợi nấm trắng đục, thô sợi. Trong khi đó bổ sung cao nấm men, pepston sinh khối sợi nấm Đầu khỉ cao, đạt 4,8-5,2 mm/ngày, so với đối chứng chỉ đạt 3,0 mm/ngày; Các phụ gia nên lựa chọn là cám gạo, bột ngô hoặc mầm malt. + Môi trường thích hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ: kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát thực tế cho thấy ở công thức môi trường CT3: khoai tây: 200g; glucose: 20g; pepton: 1,5g; cao nấm men: 1,5g; MgSO 4 .7H 2 O: 1g; KH 2 PO 4 : 1 g; thiamin: 30 µg; nấm sò tươi: 100g; cám gạo: 10g; cám ngô: 10g; agar: 20g; nước cất: 1000 ml có đầy đủ chất khoáng đồng thời có bổ sung cám ngô, cám gạo nên hệ sợi sinh trưởng tốt hơn, hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng khoẻ, tốc độ mọc nhanh đạt 8,4 mm/ngày; như vậy, CT3 là công thức môi trường phù hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ. - Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ: kết quả cho thấy, giống gốc nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 24 ± 2 o C; Hệ sợi dày, trắng đậm, sợi mượt bám sát bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể rất muộn; Tốc độ sinh trưởng đạt 8,5 mm/ ngày. Ở nhiệt 28 ± 2 o C hệ sợi phát triển nhanh hơn, tốc độ sinh trưởng đạt 8,9 mm/ngày nhưng hệ sợi mảnh, trắng mờ, sợi khô bám sát bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể khi hệ sợi chưa ăn kín bề mặt thạch; Lựa chọn nhiệt độ 24 ± 2 o C để nuôi giống nấm nấm Đầu khỉ trong các thí nghiệm tiếp theo. 5 Từ kết quả khảo sát các điều kiện phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ đã trình bày, NCS xin đề xuất sơ đồ tóm tắt qui trình phân lập lại giống gốc nấm Đầu khỉ như hình 3.12 dưới đây. Hình 3.12: Sơ đồ tóm tắt qui trình phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ 3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể. Ở phần này trình bày kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp để nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp trung gian cấp 1 dung tích 200 ml, giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 ml và giống sử dụng trong nuôi trồng dung tích 120 lít, từ đó xây dựng được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp. 3.2.1. Nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus trung gian cấp 1 dạng dịch thể dung tích 200ml - Xác định chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: kết quả cho thấy khử trùng ở nhiệt độ 115 o C trong 30 – 35 phút là thích hợp nhất vì ở điều kiện khử trùng này môi trường dinh dưỡng vừa đảm bảo vô trùng vừa không bị mất dinh dưỡng. - Xác định công thức môi trường thích hợp để nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1: Kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát thực tế cho thấy nấm Đầu khỉ phát triển tốt trong công thức môi trường CT 8 có thành phần: Glucose: 15g; Pepton: 2,5g; CNM: 2g; MgSO 4 .7H 2 O: 1g; KH 2 PO 4 : 1g; K 2 HPO 4 : 1g; (NH 4 ) 2 HPO 4 : 1g; Thiamin: 20 µg; Nước:1000 ml; hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng khoẻ, lượng sinh khối tăng nhanh đạt 0,54 g/100ml/ 7 ngày nuôi. - Xác định pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể thích hợp: kết quả cho thấy giống nấm Đầu khỉ có sinh khối sợi lớn nhất khi pH ở mức 6,5 là 0,56g/100ml/7 ngày nuôi, ở pH 4 và pH 8 hệ sợi phát triển kém chỉ đạt 0,12 – 0,35g/100ml/7 ngày nuôi cấy;Như vậy ngưỡng pH thích hợp cho hệ sợi nấm Đầu khỉ phát triển là từ 6 – 7, phát triển tối ưu ở pH 6,5. Quả thể nấm Đầu khỉ đang trong giai đoạn phát triển 7-9 ngày tuổi, hình thái quả thể cân đối, không nhiễm bệnh Chuẩn bị môi trường với thành phần: 200g/l khoai tây; 20g/l glucose; 1,5g/l pepton; 1,5 g/l CNM; 0,5g/l MgSO 4 ; 1g/l KH 2 PO 4 ;1g/l K 2 HPO 4 ; 30µg/l thiamin; 100 g/l nấm sò tươi; 10 g/l cám gạo; 10g/l bột ngô; 20g Agar; pH 6,5. Khử trùng. Đổ môi trường ra đĩa petri vô trùng, để nguội Xử lý sơ bộ, đưa vào box cấy vô trùng, thu bào tử hoặc mô nấm Nuôi sợi trong điều kiện nhiệt độ 24±2 o C, ánh sáng mờ hoặc không có ánh sáng. Loại bỏ những mẫu nhiễm, sợi phát triển yếu, chậm hơn so với những mẫu cấy cùng đợt. Kiểm tra chất lượng giống sau 2 ngày cấy, định kỳ kiểm tra 2-3 ngày 1 lần. Thời gian nuôi 12 - 14 ngày. Giống gốc đạt tiêu chuẩn 6 - Xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể: Tỷ lệ giống cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới tốc độ sinh trưởng của giống nấm và đặc điểm hệ sợi trong môi trường dịch thể. Tỷ lệ giống cấy quá cao hay quá thấp đều làm giảm tốc độ sinh trưởng của giống cũng như làm thay đổi kích thước của khuẩn lạc cầu; Theo một số nghiên cứu đã được công bố thì kích thước khuẩn lạc cầu không nên quá to hay quá nhỏ, kích thước thích hợp trong khoảng 1,2 – 1,7 mm. Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi trường CT8 Với tỷ lệ giống cấy thích hợp hợp khi nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể là 4% cho kết quả lượng sinh khối đạt 0,58 g/100ml/7 ngày nuôi cấy, kính thước KLC đạt 1,3 – 1,5 mm. - Xác định nhiệt độ giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể: Nhiệt độ có ảnh hưởng rất rõ rệt đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường dịch thể; Ở điều kiện nhiệt độ dưới 20 o C hệ sợi phát triển rất kém, thậm chí không có hiện tượng nẩy mầm của sợi nấm gốc; Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 21 – 24 o C, phát triển tối ưu ở điều kiện 24 o C. Ở điều kiện từ 27 o C hệ sợi phát triển kém dần và ngừng phát triển khi nhiệt độ tăng đến 33 o C. NCS chọn điều kiện nhiệt độ 24±2 o C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. - Xác định chế độ nuôi giống: Chế độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể khác nhau có ảnh hưởng khá lớn đến sinh khối sợi nấm đồng thời có vai trò quyết định hình thái hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể. Trong công tác nhân giống điều tối kị là để xuất hiện quả thể ngày trong quá trình nhân chuyển các cấp giống; Vì vậy không thể nuôi giống trung gian cấp 1 ở chế độ nuôi tĩnh mà phải lựa chọn một trong hai chế độ khuấy hoặc lắc để nuôi giống nhằm làm tăng lượng sinh khối trong dịch nuôi. Tùy vào mục đích nhân giống mà lựa chọn chế độ nuôi dùng khuấy từ hoặc dùng bàn lắc để đạt được hiệu quả cao nhất; Dưới đây là hình ảnh khi nuôi giống Đầu khỉ dạng dịch thể ở các chế độ khác nhau; a. Hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi tĩnh b. Hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi chế độ khuấy từ c. Hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi chế độ khuấy từ lắc Hình 3.18: Hình thái hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 ở từng điều kiện nuôi 7 + Xác định chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 khi nuôi trên máy lắc: Khi nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể trên máy lắc với tốc độ lắc phù hợp (140 - 160 v/p) sẽ thu được giống nấm chất lượng tốt với các đặc điểm: lượng sinh khối sợi lớn, đạt 0,58 - 0,6 g/100ml/7 ngày nuôi, hệ sợi kết lại với nhau tạo thành các khuẩn lạc cầu có kích thước đồng đều, kích thước khuẩn lạc cầu không quá to hoặc quá nhỏ, đạt 1,3 - 1,5 mm, xung quanh khuẩn lạc cầu có nhiều tua gai có xu hướng nhân lên rồi đứt gãy khỏi khuẩn lạc cầu mẹ để tạo khuẩn lạc cầu mới. + Xác định chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 khi nuôi trên máy khuấy từ: Khi nuôi giống nấm trung gian cấp 1 dạng dịch thể với con khuấy từ kích thước 2cm; tốc độ khuấy 140 - 160v/p cho sinh khối sợi đạt 0,56 g/100ml/7ngày nuôi; Hệ sợi dưới tác động của con khuấy từ bị đánh tan không có khả năng cuộn lại với nhau tạo dạng khuẩn lạc cầu. - Xác định đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể. Hình 3.20: Đường cong sinh trưởng của giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8 Nhìn vào đường cong sinh trưởng của giống nấm nấm Đầu khỉ cho thấy: + Giai đoạn thích nghi của giống ngắn, xuất phát từ thời điển cấy giống cho đến 48 giờ sau khi cấy. Trong giai đoạn này không thấy có sự thay đổi rõ về hình thái cũng như kích thước hệ sợi nấm. + Giai đoạn tăng sinh kéo dài từ sau 24 giờ nuôi cho đến hết 144 giờ kể từ khi cấy giống; Đây là giai đoạn phát triển tối đa của giống; Hình thái hệ sợi cũng thể hiện rất rõ sinh lực giống đang trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ nhất thể hiện như sau: hệ sợi phát triển đồng đều, các khuẩn lạc cầu tăng kích thước nhanh chóng, xung quanh khuẩn lạc cầu xuất hiện nhiều tua gai, các tua gai liên tục đứt gãy khỏi khuẩn lạc cầu ban đầu để tiếp tục nhân lên, xoắn lại với nhau để tạo thành khuẩn lạc cầu mới do đó trong giai đoạn này khuẩn lạc cầu vừa tăng sinh về kích thước lẫn số lượng. + Giai đoạn cân bằng của giống kéo dài từ 144 giờ nuôi trở đi, đây là đặc điểm khác biệt của giống nấm Đầu khỉ nói riêng và giống nấm lớn nói chung so với vi nấm; Pha cân bằng có thể kéo dài hàng chục ngày, tiếp đó hệ sợi nấm không chết đi mà chuyển sang một trạng thái mới, hệ sợi bện kết lại với nhau tạo mảng, tạo khối dày, dai, sau đó hình thành quả thể ngay trong môi trường dịch thể; Quả thể phát triển và lụi tàn dần khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt. Pha suy vọng bắt đầu diễn ra sau 30 - 35 ngày nuôi cấy. Trong công tác nhân giống, chúng tôi không quan tâm nhiều đến giai đoạn cân bằng và suy vong của giống mà chỉ nghiên cứu để nắm được đặc điểm phát triển của giống; điều quan trọng nhất trong nhân giống dạng dịch thể là tìm được giai đoạn tăng sinh của giống để khai thác sử dụng; Đối với giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 giai đoạn này kéo dài từ sau 72 đến 144 giờ nuôi cấy (3 - 6 ngày). 8 Như vậy, sau khi đã khảo sát các điều kiện nhân giống trung gian cấp 1 nấm Đầu khỉ, NCS xin đề suất sơ đồ qui trình tóm tắt như sau: Hình 3.21: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể, dung tích 200ml 3.2.2. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (thể tích 2000ml – 5000ml) Qua quá trình nghiên cứu đã xác định được các điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 lít, bao gồm các điều kiện: - Thành phần môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 thích hợp: Glucose: 15g; Pepton TQ: 4g; MgSO 4 .7H 2 O: 1g; KH 2 PO 4 : 1g; K 2 HPO 4 : 1g; (NH 4 ) 2 HPO 4 : 1g; thiamin: 20 µg; nước cất: 1000 ml, pH 6,5; dầu đậu tương 0,5 ml/1 lít môi trường; Nấm tươi, cắt chân, rửa sạch Khoai tây gọt vỏ, thái lát mỏng 1,5 cm Trộn hai dịch chiết với nhau, bổ sung nước cho đủ 800 ml Cấy giống Luộc trong 300 ml nước sạch/ 10- 15 phút, lọc lấy nước chiết Đổ dịch vào chai 500ml, làm nút bông, hấp khử trùng, để nguội. Nuôi sợi trên máy lắc 150 vòng/ phút Hỗn hợp dịch nuôi Bổ sung 500 ml nước; Đun sôi 10 - 15 phút, lọc lấy nước chiết Glucose: 15g; Pepton: 2,5g; CNM: 2g; MgSO 4 .7H 2 O: 1g; KH 2 PO 4 : 1g; K 2 HPO 4 : 1g; (NH 4 ) 2 HPO 4 : 1g; Thiamin: 20 µg Hòa tan hoàn toàn trong 200ml nước Chuẩn bị phòng cấy, dụng cụ cấy, giống gốc. Nhiệt độ nuôi 24± 2 o C. Thời gian nuôi 3-6 ngày Quan sát hệ sợi, đánh giá chất lượng giống dạng dịch thể. Giống nấm dạng dịch thể trung gian cấp 1 Tỷ lệ giống 4% so với thể tích [...]... dụng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể Qua quá trình nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống dạng dịch thể các cấp và qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể, cho thấy việc nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể là rất khả thi, mang lại hiệu quả kinh tế cao do: Rút ngắn được tổng thời gian cho một chu kỳ nhân giống và nuôi trồng. .. liệu nuôi trồng Hình 3.37: Qui trình lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120lit 3.3 Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể Để nghiên cứu xây dựng được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể đồng thời khẳng được các ưu điểm của qui trình khi sử dụng giống dạng dịch thể so với qui trình. .. số tách chiết tử nấm Đầu khỉ được đánh giá tác dụng bảo vệ phóng xạ trên thực nghiệm và cho kết quả dương tính rõ rệt Chƣơng 4 KẾT LUẬN Sau quá trình nghiên cứu về nấm Đầu khỉ H erinaceus từ khâu nuôi trồng khảo nghiệm, tuyển chọn giống; Phân lập lại giống gốc; Nhân giống, sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm thương phẩm; Tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm và thử hoạt tính sinh học. .. giá chất lượng giống dạng dịch thể Giống nấm dạng dịch thể trung gian cấp 2 Hình 3.30: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể, dung tích 5000ml 3.2.3 Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dụng tích 120 lít Qua quá trình nghiên cứu đã xác định được các điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120 lít phục vụ nuôi trồng, bao gồm: 9 - Thành... trên thóc và que sắn Giống sử dụng để nuôi trồng, dung tích 100 lít – 300 lít Giống nấm dạng rắn phát triển trong cơ chất tổng hợp Giống nấm dạng dịch thể phát triển trong cơ chất tổng hợp Quả thể nấm Đầu khỉ thương phẩm nuôi trồng trên nguồn cơ chất tổng hợp Hình 3.45: So sánh QT sử dụng giống dạng hạt và QT sử dụng giống dạng dịch thể trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ 17 3.4 Kết quả tách chiết polysaccharide. .. hợp cho ra quả thể nấm Đầu khỉ He1 là 20 - 22oC; Ở nhiệt độ 24 – 26oC vẫn có thể trồng nấm Đầu khỉ nhưng nên đóng bịch nhỏ hơn để thu hái một lần sẽ hiệu quả hơn khi đóng bịch 800g thu hái hai lần Sau khi đã khảo sát các yếu tố thích hợp cho nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể; NCS xin đề xuất quy trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể tóm tắt như... tích 120 lít; Từ đó đề xuất được qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể trung gian cấp 1 dung tích 200 ml; Qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể trung gian cấp 2 dung tích 5000 ml; Qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể dung tích 120 lít sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp Với các điều kiện nhân giống như sau: - Nhân giống trung gian cấp 1 dung tích 200ml:... trộn đến tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ được ghi ở hình 3.40; Hình 3.40: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các công thức nuôi trồng khác nhau khi sử dụng giống cấy dạng hạt và giống cấy dạng dịch thể Kết quả nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên cả bốn công thức đều cho thấy tốc độ phát triển của hệ sợi khi cấy giống dạng dịch thể phát triển nhanh hơn so với cấy giống dạng hạt; Kết quả... học của polysaccharide thu được, NCS xin đưa ra một số kết luận sau: 1 Đã nuôi trồng khảo nghiệm 4 chủng nấm Đầu khỉ H erinaceus và tuyển chọn được chủng ký hiệu He1 có chất lượng tốt, thành phần dinh dưỡng trong quả thể nấm thành phẩm cân đối, năng suất cao, có đặc tính sinh học phù hợp với điều kiện nuôi trồng tại Việt Nam 2 Đã đề xuất được qui trình phân lập, thuần khiết lại giống nấm Đầu khỉ He,... lít có sục khí, thời gian nuôi 4 - 6 ngày; trước khi đưa ra sử dụng được kiểm tra độ thuần khiết của giống, đảm bảo giống không nhiễm khuẩn, nhiễm mốc, sinh lực giống khỏe - Giống dạng dịch có màu vàng đậm của môi trường nhân giống; dịch nuôi trong, có mùi thơm đặc trưng của nấm Đầu khỉ, không phân tầng, mật độ hệ sợi dạng cầu (khuẩn lạc cầu) dày đặc, sinh khối sợi đạt 0,7 – 0,8 g/ 100 ml giống dịch thể; . nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống dạng dịch thể các cấp và qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể, cho thấy việc nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch. nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể. Để nghiên cứu xây dựng được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch. dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn; - Đưa ra được qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống dạng dịch thể; - Đã tách chiết và bước đầu khảo