TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM oOo BÙI THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ ðẶC TÍNH ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS VKNN1 LUẬN VĂN THẠC SỸ HÀ NỘI – 2014 TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM oOo BÙI THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ ðẶC TÍNH ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS VKNN1 CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH MÃ SỐ : 60.54.01.04 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS NGÔ XUÂN MẠNH HÀ NỘI – 2014 Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch Page i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014 Học viên Bùi Thị Hường Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch Page ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh, trưởng bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn chuyên môn cho tôi trong thời gian thực hiện và hoàn chỉnh luận văn. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đặc biệt, con xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất đến bố mẹ và những người thân trong trong gia đình đã luôn luôn quan tâm, lo lắng và tạo điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình học tập, để con hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Mặc dù đã rất cố gắng nhưng bản luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế. Vì vậy, tôi kính mong nhận được sự quan tâm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô để bản luận văn này được hoàn thiện hơn. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014 Học viên Bùi Thị Hường Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch Page iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục chữ viết tắt viii PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích – yêu cầu 2 1.2.1 Mục đích 2 1.2.2 Yêu cầu 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Khái niệm về enzyme chitosanase 3 2.2 Phân loại enzyme chitosanase 3 2.2.1 Dựa vào sự tương đồng của chuỗi amino acid 3 2.2.2 Dựa vào sự phân cắt đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase 5 2.3 Một số đặc tính của enzyme chitosanase 6 2.3.1 Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase 6 2.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 7 2.3.3 Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase 8 2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới sự hoạt động của enzyme chitosanase 9 2.3.5 Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt động của enzyme chitosanase 10 2.4 Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide 12 2.4.1 Ứng dụng của enzyme chitosanase 12 2.4.2 Ứng dụng của CHOS 12 Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch Page iv 2.5 Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase 15 2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme chitosanase đã được dùng trong sản xuất chitosanase 15 2.5.2 Vi khuẩn Bacillus licheniformis 15 2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 17 2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase 20 2.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trên thế giới 20 2.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước 21 PHẦN 3 VẬT LIỆU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Vật liệu 23 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 3.1.2 Môi trường nuôi cấy 23 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng 23 3.1.4 Địa điểm nghiên cứu 24 3.1.5 Thời gian nghiên cứu 24 3.2 Nội dung nghiên cứu 24 3.3 Bố trí thí nghiệm 24 3.3.1 Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 24 3.4 Phương pháp phân tích 30 3.4.1 Xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp quang phổ sử dụng acid dinitrosalicylic DNS 30 3.4.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 32 3.4.3 Tủa phân đoạn enzyme bằng amoni sunphate 33 3.4.4 Phân chia protein bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE cellulose 33 3.5 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 33 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch Page v VKNN1 sinh tổng hợp cao chitosanase 34 4.1.1 Kết quả thực nghiệm thăm dò đơn yếu tố 34 4.1.2 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình nuôi cấy từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 36 4.1.3 Kiểm tra mô hình 41 4.1.4 Xác định đường cong động học sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 41 4.2 Xác định điều kiện thu nhận và tinh sạch chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 43 4.2.1 Tủa phân đoạn enzyme chitosanase bằng muối amoni sunphate 43 4.2.2 Phân chia enzyme chitosanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 44 4.2.3 Điện di đồ enzyme chitosanase 45 4.3 Xác định một số đặc tính chitosanase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis (chủng VKNN1) 46 4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính của chitosanase 46 4.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính của enzyme chitosanase 47 4.3.3 Ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến độ bền của enzyme chitosanase 47 4.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của enzyme chitosanase 48 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Các chủng vi sinh vật đại diện cho mỗi họ enzyme 4 2.2 Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất 5 2.3 Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 7 2.4 Cơ chất đặc hiệu của enzyme chitosanase từ Bacillus sp. KCTC 0377BP 9 2.5 Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được từ một số vi sinh vật khác nhau 10 2.6 So sánh đặc tính của một số enzyme chitosanase được sản xuất từ vi sinh vật 11 2.6 Điều kiện nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi sinh vật sinh chitosanase 19 2.7 Sơ lược kết quả nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới 20 3.1 Ma trận thực nghiệm 26 3.2 Thành phần bản điện di theo phương pháp Schägger và Von Jagow (1987) cho 2 bản gel 29 4.1 Các mức thí nghiệm 37 4.2 Ma trận thực nghiệm 37 4.3 Ma trận kết quả 38 4.4 Kết quả kiểm tra mô hình 41 4.5 Hoạt tính, hàm lượng protein và hoạt tính riêng của enzyme chitosanase ở các nồng độ muối khác nhau 43 4.6 Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme chitosanase phân chia 45 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính xúc tác của enzyme chitosanase 46 4.7 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase 47 4.9 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme chitosanase 49 Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch Page vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase thu được từ Streptomyces sp.174 6 2.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 8 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 34 4.2 Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 35 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 35 4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến hoạt tính chitosanase 39 4.5 Prediction Profiler của hàm mục tiêu chitosanase 40 4.6 Đường cong sinh trưởng và hoạt tính chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 42 4.7 Sắc ký đồ phân chia enzyme chitosanase 44 4.8 Điện di đồ chitosanase qua các bước làm sạch 45 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ bền của enzyme chitosanase 48 Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch Page viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên ñầy ñủ CHOS Chitosan Oligosaccharide DA Degree of deacetylation DP Degree of polymerization DNS Acid dinitro salisylic DEAE Diethylaminoethyl GlcN D – Glucosamine GlcNAc N-acetyl-D-Glucosamine [...]... ưu vi khu n Bacillus licheniformis VKNN1 có kh năng sinh t ng h p enzyme chitosanase cao - Xác ñ nh ñư c ñi u ki n thu nh n enzyme chitosanase thô t vi khu n Bacillus licheniformis VKNN1 ñã ch n ñ thu nh n enzyme chitosanase ch ph m - Xác ñ nh ñư c m t s ñ c tính c a enzyme chitosanase thu nh n t khu n Bacillus licheniformis VKNN1 2 vi PH N 2 T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Khái ni m v enzyme chitosanase Enzyme. .. n hành nghiên c u ñ tài: Nghiên c u thu nh n và xác ñ nh m t s ñ c tính enzyme chitosanase t vi khu n Bacillus licheniformis VKNN1 1.2 M c ñích – yêu c u 1.2.1 M c ñích Nghiên c u t i ưu hóa quá trình nuôi c y vi khu n Bacillus licheniformis VKNN1 ñ t ng h p enzyme chitosanase, bư c ñ u làm s ch và xác ñ nh m t s ñ c tính c a enzyme này 1.2.2 Yêu c u - Xác ñ nh ñư c các ñi u ki n nuôi c y và xây... licheniformis VKNN1 t ñó xây d ng ñư c mô hình nuôi c y t i ưu c a ch ng vi khu n này b ng bài toán quy ho ch th c nghi m - Xác ñ nh quy trình tinh s ch enzyme chitosanase t ch ng vi khu n Bacillus licheniformis VKNN1 - Xác ñ nh m t s ñ c tính c a enzyme chitosanase thu nh n t vi khu n Bacillus licheniformis VKNN1 3.3 B trí thí nghi m 3.3.1 Nghiên c u phương pháp nuôi c y vi khu n Bacillus licheniformis VKNN1. .. có r t nhi u nh ng nghiên c u trên th gi i thu nh n chitosanase t Bacillus sp như: Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus alvei, và Bacillus licheniformis Theo Yasushi Uchida et al (1994), Bacillus licheniformis UTK ñư c phân l p t ñ t cho th y kh năng sinh chitosanase ngo i bào Sau khi nuôi c y và thu d ch thô enzyme, th c hi n... u nghiên c u Tuy nhiên quá trình nghiên c u chitin/chitosan ch th c s có h th ng vào gi a th k 20, quy trình s n xu t chitosanase hi n nay chưa có trên quy mô công nghi p ch ti n hành nghiên c u trong vi n và các trư ng ñ i h c B ng 2.7: Sơ lư c k t qu nghiên c u v enzyme chitosanase trên th gi i ð tài nghiên c u Nghiên c u sinh t ng h p và tinh s ch, xác ñ nh ñ c tính enzyme chitosanase t ch ng Bacillus. .. ñi m là s n có và chưa ñư c khai thác nhi u trong các nghiên c u trư c ñây Vi t Nam Trên th gi i cũng ñã có khá nhi u ñ tài nghiên c u v enzyme chitosanase ñư c t ng h p t các loài vi sinh v t Tuy nhiên, Vi t Nam cho ñ n th i ñi m này, nh ng nghiên c u v chitosanase và các loài vi sinh v t s n sinh ra nó còn r t h n ch Chính vì nh ng lí do ñó, ñ góp ph n vào vi c nghiên c u và ng d ng chitosanase, chúng... béo phì và ñi u tr thoái hóa kh p ñã ñư c B Y t c p phép lưu hành toàn qu c vào ñ u tháng 6/2005 Dư i ñây là m t s ñ tài nghiên c u v chitosanase: Tên ñ tài Phân l p và tuy n ch n ch ng sinh t ng h p chitosanase ñ thu nh n chitooligosaccharide Nghiên c u thu nh n ho t ch t sinh h c chitooligosaccharide b ng enzyme chitosanase cho y dư c Vi t Nam Bư c ñ u nghiên c u thu nh n ch ph m chitosanase k thu t... Công ngh lên men, Vi n Công ngh sinh h c – Vi n Khoa h c và Công ngh Vi t Nam Có th nói ch ph m chitosan, chitosanase và CHOS s còn là m t lĩnh v c m r ng và ñang ñư c quan tâm không ch c a các nhà nghiên c u mà còn c a các nhà s n xu t trong nư c và qu c t 22 PH N 3 V T LI U – N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 V t li u 3.1.1 ð i tư ng nghiên c u Vi khu n Bacillus licheniformis VKNN1 ñư c phân... (2007), ð i h c t i thích là 7, enzyme b n nhi t ñ Tamkang 25–300C, nhi t ñ t i thích cho ho t ñ ng c a enzyme là 370C và b 20 ð tài nghiên c u Tác gi và ñơn v ti n hành K t qu b t ho t 600C Tinh s ch và xác ñ nh tính ch t c a Chitosan và Chitosanase t ch ng vi khu n Pseudomonas sp TKU015 v i vi c s d ng v tôm như là m t cơ ch t Ho t tính t t nh t c a Chitosan và Chitosanase ñư c xác ñ nh pH t 4 ñ n 6 Nhi... ho t tính c a enzyme chitosanase, trong khi ñó các ion Hg2+, Cu2+, Co2+, Zn2+ và Ag+ l i có th c ch ho t tính c a enzyme này Fe3+ kích thích ho t tính chitinase nhưng l i c ch m nh ho t tính chitosanase Các ion kim lo i khác không gây nh hư ng ñ n ho t ñ ng c a enzyme này Ho t tính c a enzyme chitosanase gi m kho ng 50% n u thêm KCl 0.4M ho c NaCl 0.4M vào h n h p ph n ng 10 B ng 2.6: So sánh ñ c tính . thu nhận enzyme chitosanase thô từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 đã chọn để thu nhận enzyme chitosanase chế phẩm - Xác định được một số đặc tính của enzyme chitosanase thu nhận từ vi. vào vi c nghiên cứu và ứng dụng chitosanase, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu thu nhận và xác ñịnh một số ñặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ ðẶC TÍNH ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS VKNN1 CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH MÃ SỐ : 60.54.01.04