XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG GVHD: Th.S Lâm Thanh Hiền Thực hiện: Huỳnh Minh Duy, Nguyễn Văn Phú Khoa Công Nghệ Sau Thu Hoạch Sumary : The research of Post-harvest Technology Faculty’s students and teachers have successfully applied the method of Thin Layer Chromotography with two columns: immuno- affinity column and silicagel column to determine Aflatoxin B 1 (produced by Aspergillus flavus and Aspergillus paraciticus) on 30 samples (of peanut and corn) at its minimum concentration of 2ppb. This rapid, simple and economic method has served extension work for developing food safety control. I. Đặt vấn đề: Thức ăn gia súc, thực phẩm và các loại hạt có dầu, thảo dược,…đều có khả năng nhiễm độc tố nguy hiểm aflatoxin B 1 do 2 loài vi nấm điển hình là Aspergillus flavus (hình 1) và Aspergillus paraciticus gây nên. Các aflatoxin là những tinh thể màu vàng tan trong một số dung môi hữu cơ (clorofoc, methanol, acetone,…) và độc tính cao, rất bền vững với tác nhân hóa lí , chỉ bị huỷ ở nhiệt độ trên 120 0 C trong môi trường kiềm. Do cấu trúng hóa học có vòng dihydrofuran (hình 2) nên aflatoxin B 1 liên kết với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong. Ngoài ra, aflatoxin B1 còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA) gây tổn thương gan và gây ung thư gan. Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến di tật thai nhi hoặc quái thai, nặng có thể chết non. Hình 1:Aspergillus flavus Hình 2: Cấu trúc aflatoxin B1 (C 17 H 12 O 6 ) Do đó, việc kiểm tra thực phẩm có nguy cơ nhiễm aflatoxin B 1 là rất cần thiết. Theo tiêu chuẩn Việt Nam, thực phẩm dùng cho người lượng aflatoxin không vượt quá 10ppb. Để phát hiện và định lượng aflatoxin, hiện nay 2 nhóm phương pháp chính sau:  Nhóm phương pháp hóa lí: sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng cao áp (HPLC)  Nhóm phương pháp miễn dịch học: miễn dịch phóng xạ (RIA), miễn dịch enzym (ELISA) và cột sắc kí ái lực miễn dịch. Đối với phương pháp sắc kí lỏng cao áp, trước khi phát hiện phải trải qua rất nhiều thao tác phức tạp như chiết lấy aflatoxin từ vật liệu, sau đó phải cô đặc trước khi định lượng nên tốn nhiều thời gian thao tác kĩ thuật, hơn nữa thiết bị đầu tư rất đắt tiền. Với phương pháp ELISA, lại có nhiều hạn chế vì aflatoxin thường không bám đặc hiệu vào các giếng polystirene, khoảng phát hiện hẹp, và cần phải có aflatoxin đánh dấu hoặc kháng thể đánh dấu, sai số lớn mặc dù có độ nhạy cao. Vì những lí do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin B1 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng sử dụng cột ái lực miễn dịch và cột silicagel” trong mẫu hay nhiễm nhất là đậu phộng và bắp với những ưu điểm sau:  Cô đặc trên cột với nồng độ thấp và loại bỏ được tạp chất ảnh hưởng đến qui trình định lượng.  Thời gian tiến hành nhanh, độ nhạy cao, thiết bị đơn giản và hóa chất ít. II. Vật liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu -Bắp hạt và đậu phộng lấy từ chợ Bà Chiểu, Chợ Tân Sơn Nhất. -Bắp hạt và đậu phộng lấy của một số công ty. 2.2. Thiết bị và hóa chất -Thiết bị: + Bột thiết bị chạy sắc kí TLC + Dụng cụ làm khô gia nhiệt, bình thổi khí, đèn soi + Các tấm silicagel 10 x 10 cm mua từ Merk + Microsylinge Halmilton 10µ + Các dụng cụ thủy tinh cần thiết -Hóa chất : acetonlintril, methanol, benzen (tinh khiết) và nước cất + Dung dịch triển khai: 2 18 = Acetone Chloroform ; dung dịch hòa cặn: 2 98 ln = itrilAceto Benzen + Aflatoxin B1 chuẩn 0,5ppm trong dung dịch hòa cặn. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 2.3.1. Nơi tiến hành nghiên cứu: Phòng thí nghiệm phân tích hóa sinh, công ty cổ phần giám định và khử trùng FCC. 2.3.2. Tiến trình nghiên cứu: → cột IAC → kết quả IAC Bắp hạt + đậu phộng → → sắc ký bản mỏng TLC → → cột silicagel → kếtquả silicagel 2.3.3. Qui trình thực hiện: 2.3.3.1. Sơ đồ phân tích hàm lượng Aflatoxin B 1 bằng cột IAC Mẫu phân tích (25gam) → chiết xuất (5g NaCl, 37,5ml nước cất, methanol 87,5ml, thời gian 30 phút) → lọc thường (thu 15 ml và cho thêm 15ml nước cất) → lọc giấy thủy tinh (thu 45ml dịch lọc) → qua cột IAC (2 giọt/phút) → làm khô dịch chiết (trong N 2 /40 – 50 0 C) → định lượng bằng TLC 2.3.3.2. Sơ đồ phân tích hàm lượng Aflatoxin B 1 bằng cột Silicagel -Chuẩn bị cột Silicagel: Sắc ký cột → cho 5gam Na 2 SO 4 khan → cho CHCl 3 tới ½ ống → cho 10g silicagel → rửa thành ống 20ml CHCl 3 → cho từ từ 15gam Na 2 SO 4 khan → cho CHCl 3 chảy tới đỉnh Na 2 SO 4 -Tiến hành: Mẫu phân tích (50gam) → chiết xuất (25ml nước cất, 250ml CHCl 3 , đậy kín và lắc mạnh trong 30 phút) → lọc thường (thu 50 ml) → cột silicagel (đã chuẩn bị) → rửa giải tạp (lần 1: 150ml C 6 H 6 , lần 2: 150ml (C 2 H 5 ) 2 O) → rửa giải Aflatoxin B 1 (150ml CH 3 OH : CHCl 3 = 3:97) → thu dịch Aflatoxin B 1 vào bình cầu → làm khô với máy cô quay chân không → hòa cặn (2ml CHCl 3 ) → làm khô (trong N 2 /40 – 50 0 C hoặc chân không/40 0 C) → định lượng Aflatoxin B 1 . III. Kết quả và bàn luận 3.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B 1 trên các mẫu phân tích . XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG GVHD: Th.S Lâm Thanh. do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin B1 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng sử dụng cột ái lực miễn dịch và cột silicagel” trong mẫu hay nhiễm nhất là đậu phộng. qua cột IAC (2 giọt/phút) → làm khô dịch chiết (trong N 2 /40 – 50 0 C) → định lượng bằng TLC 2.3.3.2. Sơ đồ phân tích hàm lượng Aflatoxin B 1 bằng cột Silicagel -Chuẩn bị cột Silicagel: Sắc