NGHIÊN CỨU CÁC THÔNG SỐ KỸ THUẬT CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT CẤY DÙNG CHO TRONG CHẾ BIẾN, BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI 1 Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương, 1 Trần Quốc Việt2 và 1 Ninh Thị Len Viện Vi sinh vật và CNSH - Đại học Quốc Gia Hà Nội; 1 Bộ môn Dinh dưỡng, TACN và Đồng cỏ - Viện Chăn Nuôi Tóm tắt Tám chủng vi khuẩn được lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp axit. Kết quả là môi trường thích hợp nhất là môi trường MRS hoặc cà chua, ở 30-37oC, pH 6-7, nồng độ NaCl 5%, trên nguồn cacbon glucose, saccharose, với các nguồn nitơ hữu cơ (peptone, cao men). Nuôi cấy lắc, thời gian 3 ngày, tỷ lệ giống cấy ban đầu khoảng 5-10%. Xây dựng các tổ hợp chủng vi sinh vật theo 2 hướng khác nhau để dùng cho thử nghiệm ủ cỏ bao gồm: hỗn hợp các chủng sinh lactic đồng hình (gồm các chủng thuộc loài Lactobacillus plantarum 2-10; 3-5, 8-10 và 9-17), hỗn hợp của các chủng đồng hình và dị hình (gồm các chủng 2-9; 9-17; L01; L19 - Tổ hợp này kết hợp giữa các loài Lactobacillus plantarum, L. pentosus và Enterococcus lactis). Các tổ hợp này được dùng trong sản xuất các chế phẩm dạng bột và dịch thể. Sau 4 tháng bảo quản, mật độ vi sinh vật vẫn duy trì ở mức cao (khoảng 108 CFU/g). 1. Đặt vấn đề Kỹ thuật ủ chua thức ăn xanh là phương pháp chế biến có quan hệ mật thiết đến các hoạt động của các vi sinh vật. Điều kiện yếm khí, nhiệt độ, bản chất của vật liệu ủ (thành phần hoá học, đặc tính vật lý vv), số lượng và cơ cấu quần thể vi sinh vật (VSV) có mặt ở nguyên liệu ủ quyết định hiệu quả lên men và chất lượng của thức ăn ủ. Rất nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành nhằm hiểu rõ bản chất của quá trình lên men, qua đó đưa ra các biện pháp kỹ thuật kiểm soát quá trình lên men trong chế biến thức ăn ủ chua. Mặt khác theo McDonald (1991), một chất cấy vi khuẩn lactic cần phải đáp ứng được các yêu cầu sau đây: (i) Phát triển mạnh, cạnh tranh được với các VK không mong muốn để chiếm được ưu thế về số lượng trong quá trình lên men; (ii) phải là những vi khuẩn lên men đồng chất để tạo ra được lượng axit lactic tối đa từ các đường hexose ngay khi chúng sẵn có; (iii) sống được trong môi trường axit (pH = 4) và có khả năng sản sinh axit hữu cơ để ức chế các VK không mong muốn khác; (iv) lên men được nhiều loại đường; (v) không sản sinh ra các các dextran không mong muốn từ đường sucrose; (vi) không sản sinh ra mannitol từ đường fructose; (vii) Không phân giải các axit hữu cơ; (viii) Sống hoặc tồn tại được trong điều kiện nhiệt độ đến 50 o C; (ix) sinh trưởng tốt trên cây, cỏ đã ủ héo có độ ẩm thấp; (x) duy trì được hoạt tính trong quá trình bảo quản. Nội dung của nghiên cứu này thuộc đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong chế biến, bảo quản để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu quả sử dụng thức ăn thô xanh, phế phụ phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại” nhằm nghiên cứu các thông số kỹ thuật (môi trường, thời gian lên men, tính tương thích của các chủng vi sinh vật ), sản xuất chế phẩm vi sinh vật cấy dạng lỏng và dạng bột dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm công, nông nghiệp. 2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Các chủng vi khuẩn lactic: 2-9; 2-10; 3-5; 4-14, 8-10; 9-17; L10; L19 được phân lập từ các mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua, bã dứa. - Các hóa chất nuôi cấy vi sinh vật, định tính, định lượng và phân loại sử dụng của các hãng Merck, Sigma, Wako… 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy và các thông số lên men thích hợp đối với các chủng VSV đã được lựa chọn. - Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật cấy đa chủng dạng lỏng và bột. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Môi trường nghiên cứu 2.1.3.1. Môi trường MRS (g/l) Glucoza-20,0; K 2 HPO4-2,0; CaCO 3 -5,0; CH 3 COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni xitrat-2,0; Pepton-10,0; MgSO 4 .7H 2 O- 0,58; Cao nấm men-5,0; MnSO 4 .4H 2 O- 0,28; Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa đủ- 1000 ml; pH= 7,0; khử trùng ở 121 o C/15 phút - Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO 3 2.1.3.2. Môi trường cà chua (g/l) Cà chua-100; Glucoza- 20; Nước cất vừa đủ-1000 ml; pH= 6,5; khử trùng ở 105 o C/15 phút 2.1.3.3. Môi trường Giá- đường (g/l) Gía-100; Glucoza- 20; Nước cất vừa đủ-1000 ml; pH= 6,5; khử trùng ở 105 o C/15 phút 2.1.3.4. Môi trường vi khuẩn axit lactic (g/l) Pepton-10, cao men-5; Natri axetat -12; glucoza-10; dung dịch A- 5ml; dung dịch B-5 ml; nước đủ 1000ml; pH-5,1-5,3 Dung dịch A: K 2 HPO4-10,0; KH 2 PO4-10,0; nước- 1000 ml Dung dịch B: MgSO 4 .7H 2 O- 4,0; NaCl-0,2; FeSO 4 .7H 2 0-0,2; MnSO 4 .H 2 O-0,2; nước- 1000 ml. 2.1.3.5. Môi trường GYP-axetat natri (g/l) Glucoza-10; cao men- 10; peptone-10; axetat natri-10; MgSO 4 .7H 2 O- 0,2; MnSO 4 .H 2 O- 10 mg; FeSO 4 .7H 2 0-10 mg; NaCl-10 mg; nước đủ 1000ml, pH-6,8 2.1.3.6. Môi trường bột chua cải tiến (g/l) Maltose-20; cao nấm men-3; Tween-80; trypticase peptone-6; nước -1lit; pH-5,6 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 2.3.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng 2.3.2.1.1. Định lượng axit theo Therner Lấy 10ml dịch nuôi vi khuẩn đã li tâm, bỏ sinh khối, bổ sung 20ml nước cất và thêm 2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90 0 ). Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích NaOH (ml) đã dùng. Độ axit được tính như sau: Hàm lượng axit (g/l)= V NaOH tiêu tốn x 0,009 2.3.2.1.2. Xác định khả năng sinh trưởng bằng mật độ quang (OD) Mật độ tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 600nm 2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy và các thông số lên men thích hợp - Lựa chọn môi trường nuôi cấy, nguồn cacbon và nitơ trong môi trường nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên 6 môi trường dịch thể khác nhau, pH 6, lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) ở nhiệt độ 37 o C. Với nguồn cơ chất là C: nuôi cấy trên môi trường MRS dịch thể chứa glucose hoặc thay thế glucose bằng 6 nguồn cacbon khác (saccharose, lactose, tinh bột tan, bột gạo, bột sắn, bột ngô). Với nguồn cơ chất là N: nuôi cấy trên môi trường MRS dịch thể chứa nguồn nitơ hữu cơ (peptone, cao men, cao thịt) hoặc thay thế bằng 4 nguồn nitơ vô cơ khác là NH 4 + , NO 3 - , NO 2 - , Urê. - Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy và pH thích hợp cho khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các bình tam giác chứa môi trường MRS dịch thể, lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút): với dải nhiệt độ cần kiểm tra là 20, 25, 30; 37 và 45 o C; ở 37 o C với dải pH khác nhau 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. - Nghiên cứu các thông số kỹ thuật cho lên men dịch thể cấp 3. Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MRS, ở 30 o C, pH 6, trên nguồn cacbon là saccharose ở các chế độ khí, tỷ lệ giống cấy (2; 5; 10 và 15%) (trong 3 ngày) và thời gian lên men khác nhau (1-7 ngày), lắc 200 v/ph. Sau thời gian lên men, xác định sinh khối (OD) và hàm lượng axit sinh ra. Từ đó chọn được các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn lactic. - Nghiên cứu khả năng tổ hợp các chủng vi sinh vật trong bảo quản chế phẩm dạng lỏng. Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy riêng rẽ và trộn với nhau theo tỷ lệ như nhau và được bổ sung 30% vào dung dịch 5% rỉ đường. Bảo quản theo thời gian. Sau 1 tuần kiểm tra số lượng vi sinh vật. 2.3.2.3. Phương pháp nghiên cứu sản xuất chế phẩm dạng lỏng và bột 2.3.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất chế chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun - Chất mang có thành phần như sau: Tinh bột-10 g; Whey- 10 g; Natri Glutamat- 0,05 g - Dịch lên men vi sinh vật- 100 ml - Nhiệt độ không khí đầu vào vòi phun: 160 o C; nhiệt độ không khí đầu ra vòi phun: 55 o C, tốc độ bơm: 2lít/giờ. Xác định số lượng vi sinh vật 2.3.2.3.2. Nghiên cứu chế phẩm dạng bột bằng phương pháp lên men xốp - 40 ml dịch lên men vi sinh vật được trộn 100g với các cơ chất cám gạo, bột gạo, bột sắn, sấy khô ở 40 o C. Xác định số lượng vi sinh vật. - Các chế phẩm dạng bột sau khi sấy khô, được đóng gói 5 kg hàn kín trong túi PE; các chế phẩm dạng dịch được phân vào các can 20l. Bảo quản chế phẩm tại các điều kiện khác nhau trong điều kiện nhiệt độ phòng (28 – 37 0 C) và nhiệt độ 10 o C. Việc kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm được tiến hành theo thời gian: 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày, 60 ngày 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Ảnh hưởng của các môi trường lên men khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Sinh trưởng và sinh axit trên các môi trường nuôi cấy có nguồn cacbon và nitơ khác nhau Điều kiện nuôi cấy Ký hiệu chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 1. Môi trường nuôi cấy: Cà chua: - Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 13,5 1,707 13,5 1,488 13,5 1,674 14,4 1,686 12,5 1,411 12,0 1,568 12,0 1,556 13.0 1,677 Giá đỗ: - Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 9,0 1,56 4,5 1,41 9,0 1,631 4,5 1,330 9,0 1,474 9.0 1,483 4,5 1,473 4,5 1,611 MRS: - Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối ( OD) 20,2 2,136 22,5 2,303 23,4 2,017 21,6 2,089 20,2 2,077 20,7 2,007 20,0 1,948 21,0 2,002 Môi trường vi khuẩn axit lactic - Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 16,2 1,009 18,0 0,977 19,0 1,199 20,0 0.877 20,3 1,209 18,0 0,934 10,8 0,787 19,8 1,025 Môi trường GYP-axetat natri - Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối ( OD) 15,2 0,914 18,0 0,901 18,0 0,923 14,0 0,654 16,0 0,900 16,8 0,919 12,6 0,763 18,0 0,780 Môi trường bột chua cải tiến Điều kiện nuôi cấy Ký hiệu chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 - Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 9,0 0,708 18,0 1,005 19,8 0,904 9,0 0,676 16,8 0,914 18,0 0,912 8,1 0,898 13,5 0,880 Cả 8 chủng lựa chọn đều sinh trưởng và sinh axit trên 6 môi trường nuôi cấy khác nhau, nhưng tốt nhất ở môi trường MRS mặc dù ở các mức độ khác nhau không nhiều giữa các chủng. Đối với 5 môi trường còn lại thì sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn trên môi trường cà chua (OD 1,411 – 1,707) là cao hơn so với môi trường vi khuẩn lactic, giá đường, GYP và bột chua cải tiến. Tuy nhiên hàm lượng axit sinh ra cao nhất trên các môi trường rẻ tiền là môi trường vi khuẩn lactic (10,8 – 20,3 g/l), thấp hơn là nuôi cấy trên môi trường cà chua (12 – 14,4 g/l). Do đó môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho các chủng vi khuẩn lactic vừa sinh axit nhiều nhất và cho tốc độ sinh trưởng cao nhất bên cạnh môi trường MRS là môi trường cà chua. 3.2. Ảnh hưởng của các môi trường chứa nguồn cacbon và nitơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic Nhìn vào các kết quả ở bảng 2 ta thấy, với các môi trường có chứa nguồn cacbon khác nhau (1 nguồn đường đơn, 2 nguồn đường kép, 4 nguồn tinh bột khác nhau), khả năng sinh trưởng và sinh axit của 8 chủng vi khuẩn đều tốt nhất trên các nguồn đường đơn và kép (trừ chủng 8-10 không mọc và chủng L01 phát triển kém trên nguồn lactose). Trong đó, khi môi trường nuôi cấy có chứa nguồn glucose thì sự sản sinh axit là cao nhất (18,8 – 22,8 g/l) và có sự đồng đều giữa các chủng; thấp hơn là trên môi trường nuôi cấy có nguồn lactose và sarcarose. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Maizirwan Mel và cs (2008) khi nghiên cứu môi trường tối thích cho sự sản sinh axit lactic của chủng Lactobacillus rhamnosus; của I. A. Adesokan và cs (2009) trên các chủng L. plantarum, L. fermentum, L. casei, L. brevis, L. acidophilus khi môi trường nuôi cấy có chứa nguồn glucose. Trên môi trường nuôi cấy có chứa nguồn cacbon là đường lactose thì chủng 8-10 không mọc nên môi trường này không được lựa chọn. Do đó, ta chọn nguồn C là sacarose là nguồn C tương đối rẻ tiền hơn thay cho nguồn glucose trong môi trường nuôi cấy để thích hợp cho các chủng nghiên cứu sinh trưởng và sản sinh axit. Khi nuôi riêng rẽ từng nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, các chủng nghiên cứu đều sinh trưởng và sinh axit nhưng kém hơn khi nuôi hỗn hợp các nguồn hữu cơ (pepton, cao men, cao thịt) với nhau trong môi trường nuôi cấy MRS. Với nguồn nitơ hữu cơ, sự sinh trưởng của các chủng cao nhất trên môi trường có chứa cao thịt, thấp hơn khi nguồn nitơ là pepton. Tuy nhiên sự sản sinh axit lại cao hơn khi môi trường nuôi cấy có chứa pepton hoặc cao nấm men. Khi thay thế nguồn nitơ hữu cơ bằng nguồn vô cơ (amon, nitrat, nitrit hoặc ure) thì sự sinh trưởng và sinh axit là giảm một cách đáng kể, các chủng đều sinh trưởng rất kém và sinh axit rất thấp. Các kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của I. A. Adesokan và cs (2009) trên chủng L. plantarum, sau 48 giờ nuôi cấy khi môi trường có chứa nguồn nitơ riêng rẽ là cao nấm men (sự sản sinh axit lactic cao nhất là 2,98 g/l) , KNO 3 (sự sản sinh axit lactic giảm còn là 0,85 g/l). Vì vậy, nguồn pepton hoặc cao nấm men hoặc hỗn hợp hai chất này được lựa chọn là nguồn nitơ có trong môi trường nuôi cấy, thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh axit của các chủng được lựa chọn. Bảng 2. Sinh trưởng và sinh axit trên các môi trường nuôi cấy có nguồn cacbon và nitơ khác nhau Điều kiện nuôi cấy Ký hiệu chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 1. Môi trường chứa nguồn cacbon D-glucoza -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 20,0 2,234 21,8 2,326 22,8 2,103 20,8 2,124 20,0 1,917 20,0 2,162 18,8 1,905 20,3 2,073 D-Lactoza -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 22,8 2,377 18,8 2,123 20,3 2,293 20,3 2,226 Khôn g mọc 20,0 2,241 9,0 1,273 20,0 2,209 Saccaroza -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 19,8 2,108 16,8 2,050 21,8 2,058 20,0 2,100 15,2 1,420 16,8 2,053 15,2 1,805 18,8 2,008 Tinh bột tan -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 14,0 0,318 14,4 0,419 15,3 0,624 13,5 0,455 14,0 0,676 14,4 0,618 14,4 0,647 14,0 0,409 Tinh bột sắn -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 5,4 0,211 3,6 0,303 4,1 0,452 3,2 0,214 4,2 0,229 4,1 0,388 4,2 0,333 5,8 0,234 Bột gạo -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 14,4 0,498 14,4 0,377 13,5 0,501 13,1 0,540 14,4 0,310 13,5 0,321 14,4 0,501 14,9 0,551 Bột ngô -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 4,1 0,259 5,8 0,407 5,0 0,510 4,1 0,315 3,6 0,321 5,4 0,545 4,5 0,374 5,8 0,422 2. Môi trường chứa nguồn nitơ Amon: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 3,2 0,180 9,0 1,343 6,8 0,282 2,7 1,240 5,0 0,347 4,1 0,244 5,4 0,161 10,8 0,265 Nitrat: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 2,2 0,347 2,2 0,542 1,6 0,300 2,6 0,736 3,2 0,371 9,0 0,445 1,5 0,325 2,6 0,368 Nitrit: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 2,2 0,298 2,2 0,317 1,6 0,341 1,4 0,276 1,4 0,208 1,2 0,327 1,2 0,280 1,4 0,338 Ure: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 0,9 0,666 2,6 0,609 0,9 0,350 0,9 0,645 2,6 0,532 1,1 0,204 1,4 0,456 1,8 0,225 Điều kiện nuôi cấy Ký hiệu chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 Pepton: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 9,6 0,96 10,4 0,649 6,6 0,75 8,2 0,713 7,6 0,644 7,6 0,723 10,4 1,034 8,7 0,960 Cao nấm men: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 8,2 0,382 10,9 1,696 10,4 0,628 6,3 1,067 9,4 0,251 7,3 0,326 11,2 1,106 7,2 0,766 Cao thịt: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 6,8 1,067 10,6 1,556 7,2 1,214 5,2 1,202 4,8 0,252 7,2 1,808 12,6 1,056 7,2 1,269 3.3. Ảnh hưởng của các nhiệt độ nuôi cấy và môi trường có độ pH khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic Tám chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau: nhiệt độ 20 - 45 o C, pH từ 3 - 9. Kết quả được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Ảnh hưởng của các nhiệt độ nuôi cấy, môi trường có độ pH khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic Điều kiện nuôi cấy Ký hiệu chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 1. Nhiệt độ nuôi cấy 20 0 C: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 18 0,212 18 0,410 20 0,331 18 0,359 18 0,200 18 0,200 18 0,322 18 0,203 25 0 C -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 13 1,249 17 1,309 10 1,437 12 1,445 18 1,219 18 1,204 20 1,456 18 1,225 30 0 C -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 21,3 2,10 23,0 2,12 20,1 2,22 22,0 2,00 20,7 2,00 20,9 2,00 19,7 1,80 21,1 2,00 37 0 C -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 20,0 2,234 21,8 2,326 22,8 2,103 20,8 2,124 20,0 1,917 20,0 2,162 18,8 1,905 20,2 2,073 45 0 C -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 12,8 0,923 14,4 0,744 12,8 0,807 11,8 0,850 11,8 0,882 11,8 0,812 12,4 0,727 11,8 0,998 2. Môi trường có pH 3 -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 20,0 0,254 18,8 0,307 20,0 0,430 20,0 0,413 22,0 0,298 22,0 0,320 22,0 0,356 20,0 0,438 4 Điều kiện nuôi cấy Ký hiệu chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 12,0 0,623 10,0 0,504 8,8 0,522 12,0 0,641 12,0 0,559 10,0 0,598 10,0 0,596 11,0 0,702 5 -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 18,0 0,970 18,0 0,892 14,4 0,679 16,2 0,898 18,4 0,878 16,2 0,883 18,4 0,899 18,0 0,838 6 -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 20 2,183 22 2,311 22,5 2,113 20,8 2,166 20,4 1,934 20,2 2,103 18,9 1,986 20,2 2,087 7 -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 18,0 1,122 18,0 1,971 18,0 0,958 18,0 1,105 18,2 0,987 18,0 0,942 18,0 0,948 18,0 0,872 8 -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 13,0 1,280 14,0 1,307 7,8 0,508 8,1 0,725 11,3 0,950 8,6 0,612 10,2 1,834 4,6 0,594 9 -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 3,2 0,423 4,2 0,302 4,8 0,322 4,8 0,402 3,2 0,369 4,2 0,391 3,2 0,315 3,0 0,303 Ở dải nhiệt độ nuôi từ 20-45 o C, khả năng sinh trưởng của cả 8 chủng vi khuẩn lactic tăng khi nhiệt độ tăng từ 20 o C lên đến 37 o C. Khi nhiệt độ tăng lên 45 o C mật độ quang giảm. Khả năng sản sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn thì cao nhất khi nuôi cấy tại nhiệt độ là 30 0 C, thấp hơn là ở nhiệt độ 37 0 C. Các số liệu cũng cho thấy, nhiệt độ từ 30 o C đến 37 o C là thích hợp nhất đối với các chủng vi khuẩn lactic. Nhìn chung, những chủng có khả năng sinh trưởng tốt cũng là những chủng có khả sản sinh axit lactic cao. Khi nuôi ở các pH từ 3-9, cả 8 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh trưởng và sinh axit, nhưng tăng dần từ pH 3-7 và giảm dần khi pH nuôi càng kiềm. Thích hợp nhất cho sinh trưởng và sinh axit ở cả 8 chủng lựa chọn là pH 6-7 với mức tương đương nhau. Các kết quả khi nuôi cấy 8 chủng ở các nhiệt độ nuôi cấy và môi trường có độ pH khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic được so sánh với các kết quả nghiên cứu của I. A. Adesokan và cs (2009) trên chủng L. plantarum khi nhiệt độ và pH tối thích là 30 0 C và 6,5. 3.4. Ảnh hưởng môi trường có nồng độ NaCl khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic Bảng 4. Ảnh hưởng của môi trường nồng độ NaCl khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic Môi trường chứa các nồng độ NaCl Ký hiệu chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 Môi trường chứa các nồng độ NaCl Ký hiệu chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 0% -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 20,0 2,234 21,8 2,326 22,8 2,103 20,8 2,124 20,0 1,917 20,0 2,162 18,8 1,905 20,2 2,073 1% -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 18,0 1,661 18,0 1,948 18,8 1,563 20 1,870 18,2 1,340 20,0 1,880 18,8 1,793 18,2 1,576 3% -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 18 1,128 18 0,998 18 0,998 20 0,963 18,2 1,150 18,2 1,086 16,2 0,861 18,9 0,896 5% -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 18 1,106 18 0,949 18 0,958 18,2 0,955 18 1,011 18 0,983 14,4 0,831 19,3 0,854 7% -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 16,2 0,601 14,4 0,436 16,2 0,699 16,2 0,663 14,4 0,641 14,4 0,613 7,0 0,472 18 0,579 8% -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 3,6 0,114 3,6 0,117 3,6 0,108 4,7 0,344 4,5 0,314 6,0 0,103 4,5 0,112 4,7 0,094 Nồng độ muối cũng ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và sinh axit của cả 8 chủng nuôi cấy, nhìn chung chúng đều phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối dưới 5%, tuy nhiên ở nồng độ cao hơn chúng vẫn có thể sinh trưởng mặc dù ở mức kém hơn. Quan sát các số liệu tại bảng 4 ta thấy khi môi trường có chứa 8% NaCl thì sự sinh trưởng của các chủng gần như bị ức chế hoàn toàn, dẫn đến sự sản sinh axit cũng kém nhất. 3.5. Nghiên cứu các thông số kỹ thuật cho lên men dịch thể cấp 3 3.5.1. Lựa chọn chế độ cung cấp khí Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MRS, ở 30 o C, pH 6, sử dụng nguồn cacbon là saccharose ở các chế độ khí khác nhau: lắc 200 v/ph; để tĩnh và nuôi trong điều kiện kị khí không bắt buộc. Sau 3 ngày, xác định sinh khối (OD), pH sau nuôi và hàm lượng axit sinh ra. Kết quả ở bảng 5. Bảng 5. Lựa chọn chế độ cung cấp khí Chế độ nuôi Chủng 2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19 Nuôi kị khí: -Hàm lượng axit (g/l) - Sinh khối (OD) 19,8 0,919 20 0,963 20,5 0,828 19,8 0,941 20 0,888 18,9 0,913 9,0 0,831 18,4 0,914 Nuôi lắc: [...]... kiện cho các vi sinh vật lạ phát triển .Vi sinh vật bị nhiễm trong chế phẩm lên men xốp này, khả năng đã có sẵn trong cơ chất và chủ yếu là các loại có bào tử nên không bị tiêu diệt khi pH giảm Vì vậy trong quá trình sản xuất chế phẩm dạng bột theo phương pháp lên men xốp có thể sử dụng cơ chất là cám gạo 3.7 Bao gói và bảo quản sản phẩm dạng bột Sản xuất 5 kg chế phẩm cho mỗi tổ hợp chủng theo các điều... sau 2 tuần và vẫn duy trì tốt sau 8 tuần Số lượng vi sinh vật trên cả 2 tổ hợp đều giảm mạnh sau 16 tuần bảo quản, chỉ còn 105 - 106 tế bào/ml Tuy vậy, nếu hoạt hóa lại bằng môi trường thích hợp số lượng vi sinh vật lại tăng lên 108 -109 tế bào/ml 3.6 Sản xuất chế phẩm dạng bột Từ các nghiên cứu tối ưu cho sản xuất chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun và phương pháp lên men xốp với các cơ chất... bảo quản theo thời gian Cứ sau 2 tuần kiểm tra số lượng vi sinh vật Bảng 8 Số lượng vi sinh vật trong các tổ hợp Thời gian quản (tuần) 0 2 4 8 12 16 bảo Số lượng vi sinh vật (cfu/ml) Tổ hợp 1 1,2 x 108 5,2 x 109 4,5 x 109 7,2 x 107 1,5 x 106 5,5 x 105 Tổ hợp 2 1,0 x 108 6,5 x 109 6,6 x 109 2,6 x 108 6,4 x 107 1,2 x 106 Kết quả sau thời gian bảo quản, cả 2 tổ hợp các chủng đều phát triển tốt, tăng số. .. Sau khi sấy khô, từ 2 phương pháp trộn trực tiếp trên cám và sấy phun, được đóng gói hàn kín trong túi PE và bảo quản trong điều kiện nhiệt độ phòng Vi c kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm được tiến hành theo thời gian: 2 tuần/lần Bảng 10 Số lượng vi sinh vật trong các tổ hợp bảo quản Thời gian bảo Số lượng vi sinh vật (cfu/ml) Tổ hợp 1 quản (tuần) Sấy phun Lên men xốp 8 0 16 x 10 6 x 109 2 14... với các nguồn hữu cơ (peptone hoặc cao men) Nuôi cấy lắc, thời gian 3 ngày, tỷ lệ giống cấy ban đầu khoảng 5-10% - Xây dựng các tổ hợp chủng vi sinh vật theo 2 hướng khác nhau để dùng cho thử nghiệm ủ cỏ bao gồm: hỗn hợp các chủng sinh lactic đồng hình, hỗn hợp của các chủng đồng hình và dị hình - Xây dựng được quy trình sản xuất cho các chế phẩm dạng bột và dịch thể - Các chế phẩm vẫn duy trì số lượng... bảng trên cho thấy, lượng giống cấy ban đầu cho quá trình lên men ở các chủng nghiên cứu thích hợp nhất cho sinh trưởng và sinh axit trong là 5% Khi tỷ lệ giống cấy tăng lên lớn hơn 5% thì sự sinh trưởng và sinh axit biến đổi không nhiều Do đó, để tiết kiệm chi phí thì tỷ lệ giống cấy thích hợp nhất cho quá trình lên men vi khuẩn lactic là từ 5 – 10% 3.5.3 Lựa chọn thời gian lên men vi sinh vật trong nồi... hợp, trong khi đó số lượng vi khuẩn nghiên cứu ở thí nghiệm lên men xốp với cơ chất là cám gạo thì cao hơn với tổ hợp 1 nhưng lại thấp hơn khi lên men với tổ hợp 2 Các cơ chất lên men là bột gạo và bột sắn thì thấp hơn hẳn.Mặt khác khi phân lập chế phẩm ở dạng sấy phun ta thấy không có các vi sinh vật nhiễm vào chế phẩm, còn trên chế phẩm dạng lên men xốp lại vẫn thấy xuất hiện các khuẩn lạc lạ nhiễm vào... axit sinh ra nhiều, giảm pH môi trường nuôi cấy dẫn đến ức chế sự sinh trưởng của chính các chủng vi khuẩn này Với các kết quả nghiên cứu của I A Adesokan và cs (2009) trên chủng L plantarum, L fermentum, L casei, L brevis, L acidophilus thì thời gian lên men thích hợp nhất lại là 48 giờ Khi thời gian lên men là 72 giờ thì sự sinh axit lactic lại có phần giảm nhẹ 3.5.4 Khả năng tổ hợp các chủng vi sinh. .. 108 9 x 108 3 x 108 Kết quả bảng 10 cho thấy, các tổ hợp chủng có số lượng không thay đổi sau 4 tuần bảo quản Số lượng tế bào giảm nhẹ sau 14 tuần bảo quản Công vi c này sẽ được tiếp tục thực hiện cho đến khi kết thúc đề tài 4 Kết luận - Tám chủng vi khuẩn được lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp axit cao nhất trên môi trường MRS và cà chua, ở 30-37oC, pH 6-7, nồng... chủng vi sinh vật trong bảo quản chế phẩm dạng lỏng Theo Mcdonald (1991), trong hỗn hợp ủ chua chất lượng tốt, sự axit hóa được thực hiện đầu tiên bởi các VK lactic lên men đồng hình, đặc biệt là các L plantarum và L curvatus, nhưng chỉ sau 4 ngày, 85% các chủng VK tham gia vào quá trình axit hóa là các chủng lên men dị hình và chúng chiếm ưu thế cho đến cuối thời kỳ lên men Một nghiên cứu khác (Dellaglio, . NGHIÊN CỨU CÁC THÔNG SỐ KỸ THUẬT CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT CẤY DÙNG CHO TRONG CHẾ BIẾN, BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI 1 Bùi Thị. phế phụ phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại nhằm nghiên cứu các thông số kỹ thuật (môi trường, thời gian lên men, tính tương thích của các chủng vi sinh vật ), sản xuất chế phẩm vi . sinh vật cấy dạng lỏng và dạng bột dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm công, nông nghiệp. 2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu