TRỊNH ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme cellulase 71 KẾT QUẢ TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME CELLULASE TỪ CHỦNG NẤM SÒ PLEUROTUS SAIJOR-CAJU Trịnh Đình Khá và Trần Thị Trà Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Tác giả liên hệ: Trịnh Đình Khá – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Tel. 0280. 3746.985; Mobil: 0983.034.876; Email: tdinhkha@yahoo.com ABSTRACT Results purification and study some properties of the enzyme cellulases from Mushroom Pleurotus saijor-caju A cellulase from basidiomycetes Pleurotus saijor-caju was purified 1.94-fold to homogeneity throughout 90% (v/v) acetone precipitation and gel filtration Sephadex G-100. Purified cellulase had a specific activity of 0.725 U/mg. Optimum temperature and pH were 45°C and 5.5, respectively. The enzyme was stable in pH range 4.5-5.5 with a residual activity of over 56% for 8 hours treatment. The metal ions Ag + , Mg 2+ , Mo 2+ , Na + , Fe 2+ , Pb 2+ , Cu 2+ , Ca 2+ and EDTA inhibited the enzyme. The organic solvens (acetone, ethanol, isopropanol) at concentration 5% (v/v) and isobutanol at concentration 5-10% (v/v) increased the cellulase activity. But the organic solvents (methanol, ethanol, isopropanol and acetone) at concentration 10% (v/v) and 2-Mercaptoethanol at concentration 5-10% (v/v) inhibited the enzyme activity. The K m and V max for carboxymethyl cellulose were 1.602 mg/ml and 0.231 U/mg, respectively. These results suggested that cellulase from P. saijor-caju could potentially be used as an additive in the feed for monogastric animals. Key words: purification, enzyme cellulases, Mushroom Pleurotus saijor-caju, additive, monogastric ĐẶT VẤN ĐỀ Cellulose là một thành phần polysaccharide chính của thành tế bào thực vật và là một trong những hợp chất hữu cơ phong phú nhất trong sinh quyển (Hong và cs., 2001). Cellulose được cấu tạo bởi các đơn vị β-1,4-glucose liên kết với nhau bởi liên kết glycoside, các enzyme cellulolytic thủy phân liên kết này để giải phóng ra glucose (Han và cs., 1995). Cellulase là một hệ enzyme gồm ba loại enzyme thủy phân: endo-(1,4)-β-D-glucanase (endoglucanase, endocellulase, CMCase [EC 3.2.1.4]), exo-(1,4)-β-D -glucanase (cellobiohydrolase, exocellulase, avicelase [EC 3.2.1.91]), và β-glucosidase (cellobiase [EC 3.2.1.21]). Endoglucanase thủy phân liên kết bên trong của chuỗi cellulose, exoglucanase thủy phân liên kết từ đầu khử và không khử còn cellobiase thủy phân liên kết trong phân tử cellobiose và các chuỗi ngắn tạo thành glucose (Bhat, Bhat, 1997). Cellulase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất bia, bột giấy, ngành công nghiệp chất tẩy rửa, ngành công nghiệp dệt may, nhiên liệu và hóa chất, quản lý chất thải và xử lý ô nhiễm (Bhat, Bhat, 1997; Ole và cs., 2002). Do có ứng dụng lớn trong công nghiệp, cellulase đã được tinh sạch và đánh giá tính chất từ nhiều chủng vi nấm như Aspergillus aculeatus, A. nidulans, A. niger, A. terreus, Trichoderma reesei (Chen và cs., 2001; Ali, El-Dein, 2008; Gao và cs., 2008; Elshafei và cs., 2009) và một số chủng nấm đảm: Laetiporus sulphureus, Flammulina velutipes, Fomitopsis pinicola, Phanerochaete VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 32 – Tháng 10 – 2011 72 chrysosporUm, Vollvariella volvacea (Henriksson và cs., 1999; Ding và cs., 2001; Hong và cs., 2001; Kenji và cs., 2008; Joo và cs., 2009). Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về enzyme cellulase và ứng dụng enzyme này trong chăn nuôi và một số lĩnh vực khác. Năm 2007, Trịnh Đình Khá và cộng sự đã tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của enzyme cellulase, đồng thời tối ưu môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme này từ chủng nấm PenicillUm sp. DTQ-HK1 (Trịnh và cs., 2007a, b). Năm 2010, Nguyễn Hữu Quân và Quyền DT đã tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm của enzyme cellulase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC-F045 (Nguyen, Quyen, 2010a); Nguyễn Văn Tuân và cộng sự đã tinh sạch, nghiên cứu đặc điểm của cellulase từ chủng Aspergillus awamori VTCC-F099, đồng thời đã tối ưu môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme này (Nguyen, Quyen, 2010b, c). Tuy nhiên, những nghiên cứu về cellulase từ các chủng nấm đảm còn hạn chế. Trong bài báo này chúng tôi tiến hành tinh sạch và đánh giá tính chất của cellulase từ chủng nấm sò Pleurotus saijo-caju làm cơ sở định hướng ứng dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và những ứng dụng khác. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng giống và môi trường nuôi cấy Chủng Pleurotus saijor-caju do Công ty nấm Sông Hồng – Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp. Chủng được nuôi cấy trên môi trường xốp chứa 80% (w/v) lõi ngô; 20% (w/v) bột đậu tương; pH 7,0; khử trùng. Hóa chất Các hóa chất: CMC (carboxyl methyl cellulose) (sigma), 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) (sigma), và một số hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam được sử dụng cho nghiên cứu. Nuôi cấy sinh tổng hợp cellulase Chủng P. saijor-caju sinh tổng hợp cellulase được nuôi cấy trong 10g môi trường lên men xốp gồm bột đậu tương và lõi ngô với độ ẩm 70% trong bình tam giác 250 ml. Sau 7 ngày lên men bổ sung100 ml nước cất khử trùng, đánh tan và lắc 200 vòng/phút trong 1h, lọc và ly tâm thu enzyme. Xác định hoạt độ cellulase Hoạt độ cellulase được xác định bằng phương pháp quang phổ theo Miller, 1959 với cơ chất 0,5% CMC trong đệm acetate 0,1M, pH 5,6. Hàm lượng đường khử giải phóng ra trong dung dịch phản ứng giữa enzyme và cơ chất được đo bằng quang phổ với bước sóng 575 nm (mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần). Độ hấp phụ được đối chiếu với đồ thị chuẩn nồng độ glucose để tính ra lượng đường giải phóng. Một đơn vị hoạt độ được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1 µmol glucose trong một phút ở điều kiện thích hợp (Miller, 1959). Tinh sạch cellulase Dịch enzyme thô được tủa sơ bộ bằng 90% (v/v) acetone, tủa protein enzyme được hòa trở lại vào đệm acetate 0,1 M, pH 5,6, sau đó được tinh sạch qua sắc ký lọc gel sephadex G-100 với tốc độ đệm rửa 30 ml/h, thu 14 phân đoạn. Dịch enzyme ở mỗi phân đoạn được xác định hoạt độ cellulase và hàm lượng protein theo phương pháp Lowry (Lowry và cs., 1951). Ảnh hưởng nồng độ cơ chất và động học enzyme TRỊNH ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme cellulase 73 Phản ứng giữa enzyme và cơ chất được thực hiện với các nồng độ cơ chất CMC khác nhau từ 0,2- 2% pha trong đệm acetate 0.1M, pH 5,6. Hoạt độ enzyme được xác định sau 15 phút phản ứng ở 30°C. Hằng số động học V max và K m được xác định dựa trên phương trình Lineweaver – Burk. Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu Hỗn hợp phản ứng của dịch enzyme với cơ chất 1% (w/v) CMC pha trong đệm acetate 0.1M, pH 5,6 được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-60°C, trong 15 phút để tìm nhiệt độ phản ứng tối ưu. Xác định pH phản ứng tối ưu Hỗn hợp phản ứng giữa dịch enzyme với cơ chất CMC 1% pha trong đệm acetate 0,1M, pH từ 4 - 8,0 được thực hiện ở 45°C trong 15 phút. Xác định độ bền nhiệt độ Dịch enzyme được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30°C - 60°C, sau các khoảng thời gian 0- 8 giờ, tiến hành xác định hoạt độ còn lại của enzyme theo phương pháp trên. Xác định độ bền pH Dịch enzyme ủ trong các đệm có pH thay đổi trong khoảng 3-8, nhiệt độ 45°C, sau các khoảng thời gian 0-8 giờ xác định hoạt độ còn lại của enzyme. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ của enzyme Dịch enzyme được ủ cùng với muối của các ion kim loại: Ag + ,Mg 2+ , Mo 2+ , Na + , Fe 2+ , Pb 2+ , Cu 2+ , Ca 2+ , EDTA với nồng độ 10mM ở 4 0 C. Sau 15 phút, hoạt độ còn lại của enzyme được xác định ở nhiệt độ 45°C, pH 5.5, với nồng độ cơ chất CMC 1%. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt độ của enzyme Dịch enzyme được ủ với 5% và 10% các loại dung môi hữu cơ: acetone, ethanol, isopropanol, methanol và isobutanol, 2-mercaptoethanol ở nhiệt độ 4°C. Sau 1 giờ ủ hoạt độ còn lại của enzyme được xác định ở nhiệt độ phản ứng tối ưu 45°C, pH 5,5, nồng độ cơ chất 1%. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tinh sạch cellulase Dịch enzyme sau khi tủa bằng acetone được sử dụng để tiến hành tinh sạch qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, sử dụng đệm acetate 0,1M, pH 5,6, tốc độ dòng chảy 30 ml/giờ. Kết quả cho thấy protein enzyme tập trung ở các phân đoạn 9, 10, 11 trong đó phân đoạn số 10 có hoạt độ cao nhất (Hình 1). Kết quả quá trình tinh sạch cellulase được thể hiện ở Bảng 1. Cellulase tinh sạch từ chủng P. saijor-caju có hoạt độ riêng 0,725 U/mg, tỷ lệ sạch đạt 1,94 lần so với dịch enzyme thô và hiệu suất thu hồi đạt 15,86%. Bảng 1. Tóm tắt quá trình tinh sạch cellulase từ chủng P.sajor-caju Bước tinh sạch Protein tổng số (mg) Hoạt độ tổng (U) Hoạt độ riêng (U/mg) Hiệu suất thu hồi (%) VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 32 – Tháng 10 – 2011 74 Dịch enyme thô 1,467 0,548 0,374 100 Dịch enzyme tủa 1,013 0,490 0,484 89,41 Dịch enzyme tinh sạch 0,12 0,087 0,725 15,86 Những nghiên cứu trước đây cho thấy: cellulase của chủng L. sulphureus var. miniatus sau tinh sạch có độ sạch 16 lần và hiệu suất thu hồi đạt 5% (Hong và cs., 2009); của chủng V. volvacea sau tinh sạch có độ sạch 42 lần và hiệu suất thu hồi 1,5% (Ding và cs., 2001); của chủng P. byssoides sau tinh sạch có độ sạch 4,5 lần và hiệu suất thu hồi 27% (Chao và cs., 2007). Như vậy, cellulase nghiên cứu có độ sạch thấp hơn nhưng hiệu suất thu hồi enzyme cao hơn những nghiên cứu đã công bố trên một số chủng nấm khác. Hình 1. Hàm lượng protein và hoạt độ cellulase của các phân đoạn sau tinh sạch Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Kết quả cho thấy, hoạt độ enzyme tăng khi tăng nồng độ cơ chất từ 0,2-1,0 và đạt cực đại ở nồng độ 1,0% CMC (0.535 U/mg). Sau đó, khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thi hoạt độ enzyme lại giảm, chỉ đạt 26,36% ở nồng độ 2% CMC (Hình 2A). Như vậy nồng độ 1% cơ chất CMC tối ưu cho phản ứng xúc tác của cellulase từ P.sajor-caju. Sự phụ thuộc vào nồng độ cơ chất của vận tốc phản ứng được biểu diễn theo phương trình Lineweaver-Burk (Hình 2B). Từ phương trình này xác định được giá trị K m = 1,602 mg/ml và V ma x = 0,231 U/phút. K m của cellulase từ chủng nấm đảm L. sulphureus var. miniatus đạt 3,7 mg/ml (Hong và cs., 2009); từ chủng A. terreus đạt 14,2 mg/ml (Nazir và cs., 2009). Như vậy, cellulase của chủng P. saijor-caju có ái lực đối với CMC cao hơn cellulase của chủng A. terreus nhưng thấp hơn cellulase của chủng L. sulphureus var. miniatus. TRỊNH ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme cellulase 75 A B Hình 2. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất CMC đến hoạt độ cellulase (A) và phương trình động học Lineweaver-Burk (B) Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH phản ứng Kết quả cho thấy, khi tăng nhiệt độ từ 30 - 45°C, hoạt độ tương đối của cellulase tăng dần từ 39,02-100% và đạt tối đa ở 45°C (0,795 U/mg). Khi tiếp tục tăng nhiệt độ thì hoạt độ của enzyme giảm còn 28,6% (0.227 U/mg) ở nhiệt độ 60°C (Hình 3A). Hoạt độ cellulase của P.sajor-caju tăng mạnh trong khoảng 4,0 - 5,5. Hoạt độ tương đối đạt 25,58% ở pH=4 và đạt cực đại ở pH=5,5 (0.775 U/ml). Sau đó, hoạt độ enzyme giảm mạnh và đạt 31,39% (0,243 U/mg) ở pH=8 ( Hình 3B). Như vậy, cellulase của chủng P. saijor-caju có nhiệt độ và pH tối ưu là 45°C và 5,5. A B Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH phản ứng (B) lên hoạt độ cellulase Nhiệt độ và pH tối ưu của cellulase từ một số chủng nấm đảm đã công bố trước đây trong khoảng 50-75°C và pH 4-7.5 như: cellulase của chủng V. volvacea là 55°C and pH 7.5 (Ding và cs., 2001), của chủng P. byssoides là 50°C và pH 6 (Chao và cs., 2007), của chủng L. sulphureus var. miniatus là 75°C và pH 4 (Hong và cs., 2009), của chủng Flammulina velutipes là 60°C và pH 6.1 (Kenji và cs., 2008), của chủng Fomitopsis pinicola KMJ812 là 50°C và pH 4.5 (Joo và cs., 2009). Như vậy, nhiệt độ và pH tối ưu của cellulase từ chủng P. saijor-caju nằm trong khoảng đã công bố trước đây trên các chủng nấm khác. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ bền của cellulase VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 32 – Tháng 10 – 2011 76 Kết quả nghiên cứu độ bền nhiệt cho thấy, sau 2 giờ ủ đầu tiên ở nhiệt độ 30 và 60 0 C hoạt độ enzyme bị giảm mạnh (xuống còn 63,47 và 41,97 %), trong khi đó, ở 45 0 C hoạt độ enzyme giảm ít hơn với hoạt độ còn lại là 85,51 %. Sau 2 giờ tiếp theo, hoạt độ của enzyme ở các nhiệt độ giảm nhẹ và đến 8h thì hoạt độ lại tiếp tục giảm. Như vậy, độ bền nhiệt của enzyme cellulase nghiên cứu là trung bình và ở 45°C bền hơn so với các nhiệt độ khác đã khảo sát (Hình 4A). Kết quả khảo sát độ bền pH cho thấy, hoạt độ của cellulase giảm nhẹ ở pH = 4 và 5 sau 2 giờ đầu ủ ( 97,96% và 94,37%), trong khi đó, ở pH=6 và 8 hoạt độ enzyme giảm mạnh chỉ còn lại 76,51% và 69,25%. Sau 4 giờ tiếp theo, hoạt độ enzyme ở pH=4 và 5,5 không thay đổi nhiều, trong khi đó ở pH=8 thì hoạt độ enzyme giảm mạnh chỉ còn 52,69%. Và sau 8 giờ ủ thì hoạt độ enzyme ở pH=6,5 và 8 chỉ còn lại 33,96% và 14,4%, còn ở pH=4 và 5,5 hoạt độ vẫn khá cao, đạt 69,17% và 58,4%. Như vậy, cellulase của chủng P. saijor-caju khá bền ở môi trường acid có pH khoảng từ 4-5,5 (Hình 4B). A B Hình 4. Độ bền nhiệt độ (A) và độ bền pH (B) của cellulase Ảnh hưởng của một số dung môi và ion kim loại Các dung môi đã sử dụng có ảnh hưởng lên hoạt độ cellulase khác nhau. Ở nồng độ 5% hầu hết các dung môi làm tăng hoạt độ enzyme, isobutanol và isopropanol làm tăng hoạt độ enzyme mạnh nhất, đạt 142,11% và 120,12%, trong khi đó, methanol làm giảm nhẹ hoạt độ enzyme xuống 98,88% và 2-Mercaptoethanol ức chế hoạt độ cellulase xuống còn 20%. Ở nồng độ 10%, các dung môi đều làm giảm nhẹ hoạt độ enzyme, riêng đối với isobutanol hoạt độ enzyme vẫn tăng so với đối chứng (Hình 5A). 2-Mercaptoethanol làm giảm mạnh hoạt độ của cellulase ở cả hai nồng độ (5 và 10%) dung môi khảo sát, chứng tỏ trong phân tử protein enzyme có các liên kết disulfide. Kết quả xác định ảnh hưởng của ion kim loại được thể hiện ở hình 5B, các ion kim loại đều ức chế hoạt độ enzyme đang nghiên cứu. Trong đó, ở nồng độ 10mM ion kim loại Ag + , Na + làm giảm hoạt độ enzyme ít nhất (hoạt độ còn lại là 65,31% và 74,49%), ức chế hoạt độ cellulase mạnh nhất là Cu 2+ và EDTA ( hoạt độ chỉ còn lại 30,22% và 33,2%). EDTA là chất ức chế đặc trưng đối với các enzyme kim loại, do đó cellulase của chủng P. saijor-caju có thể là một enzyme trong nhóm metalloenzyme. TRỊNH ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme cellulase 77 A B Hình 5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ (A) và ion kim loại (B) lên hoạt độ cellulase KẾT LUẬN Cellulase tinh sạch đạt tỉ lệ sạch 1,94 lần so với dịch enzyme thô, hiệu suất của quá trình tinh sạch đạt 15,86%. Nồng độ cơ chất phản ứng tối ưu: 1% CMC pha trong đệm acetate 0,1M, pH 5,6; Nhiệt độ phản ứng tối ưu: 45° C, pH tối ưu: 5,5; độ bền pH trong khoảng 4-5,5. Hệ số động học K m = 1,602mg/ml và V max =0,231 U/phút. Các ion kim loại có ảnh hưởng khác nhau đối với hoạt độ endoglucanase: Ag + , Mg 2+ , Mo 2+ , Na + , Fe 2+ , Pb 2+ , Cu 2+ , Ca 2+ , EDTA ức chế hoạt độ endoglucanase; Cu 2+ và EDTA có tác dụng ức chế mạnh nhất. Các dung môi hữu cơ: acetone, ethanol, isopropanol, methanol, isobutanol và 2- Mercaptoethanol có ảnh hưởng khác nhau lên hoạt độ cellulase ở nồng độ khảo sát. Isobutanol có tác dụng làm tăng mạnh nhất hoạt độ enzyme ở cả hai nồng độ khảo sát (5 và 10%), 2- Mercaptoethanol có tác dụng ức chế mạnh nhất hoạt độ enzyme. Lời cảm ơn Công trình có sự hỗ trợ của đề tài cấp Bộ Giáo dục và Đào tạo (mã số: B2010-TN06-04), đề tài: Tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm hóa sinh của enzyme cellulase từ chủng nấm Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO Ali UF, El-Dein HSS (2008) Production and partial purification of cellulase complex by Aspergillus niger and A. nidulans grown on water hyacinth blend. J Appl Sci Res 4: 875-891. Bhat MK, Bhat S (1997) Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications. Biotechnol Adv 15: 583-620. Chao L, Yang J, Sun Hui, Huang X, Wang R, Zhang KQ (2007) Purification and characterization of b-1,3-glucanase from the novel mycoparasite Periconia byssoides. Biotechnol Lett 29: 617–622. Chen G, Du J, Zhuang L, Gao P (2001) Purification and properties of endoglucanases from Aspergillus aculeatus SM-L22. Wei Sheng Wu Xue Bao 41: 469-474. VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 32 – Tháng 10 – 2011 78 Ding SJ, Wei G, Buswel JA (2001) Endoglucanase I from the edible straw mushroom, Volvariella volvacea purification, characterization, cloning and expression. Eur J Biochem 268: 5687–5695. Elshafei AM, Mohamed MH, Bakry MH, Osama MA, Housam MA, Abdelmageed MO (2009) Purification and properties of an endoglucanase of Aspergillus terreus DSM 826. J Basic Microbiol 49: 426-432. Gao J, Weng H, Xi Y, Zhu D, Han S (2008) Purification and characterization of a novel endo- beta-1,4-glucanase from the thermoacidophilic Aspergillus terreus. Biotechnol Lett 30: 323-327. Han S, Yoo Y., Kang H. (1995) Characterization of a bifunctional cellulase and its structural gene. J. Biol. Chem 270: 26012-26019. Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G (1999) Endoglucanase 28 (Cel12A), a new Phanerochaete chrysosporUm cellulase. Eur J Biochem 259: 88-95. Hong J, Tamaki H, Akiba S , Yamamoto K, Kumaga H (2001) Cloning of a gene encoding a highly stable endo-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in Yeast. J Biosci Bioeng 92: 434-441. Hong MR, Kim YS, Joo AR, Lee JK, Kim YS, Oh DK (2009) Purification and characterization of a thermostable β-1,3-1,4-Glucanase from Laetiporus sulphureus var. miniatus. J Microbiol Biotechnol 19: 818–822. Joo AR, Marimuthu J, Lee KM, Sim WI, Kim JS, Kim IW, Kim YS , Oh DK , Paramasamy G, Lee JK (2009) Purification and characterization of a β-1,4-glucosidase from a newly isolated strain of Fomitopsis pinicola. Appl Microbiol Biotechnol 83: 285–294. Kenji Fukuda, Michika Hiraga, Sadaki Asakuma, Ikichi Arai, Mitsuo Sekikawa, Tadasu Urashima (2008) Purification and Characterization of a novel Exo-b-1,3-1,6-glucanase from the Fruiting body of the Edible Mushroom Enoki (Flammulina velutipes). bisci. Biotechnol. Biochem 72: 3107-3113. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193: 265-75. Miller GL (1959) Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal Chem 31: 426–428. Nazir A, Rohit S, Saini HS, Manhas RK, Chadha BS (2009) Purification and characterization of an endoglucanase from Aspergillus terreus highly active against barley b-glucan and xyloglucan. World J Microbiol Biotechnol 25: 1189–1197. Nguyen HQ, Quyen DT (2010a) Purification and properties of an endoglucanase from Aspergillus oryzae VTCC-F045. AJBAS 4: 6217-6222. Nguyen VT, Quyen DT (2010b) Optimizing culture conditions for the production of endo-b- 1,4-glucanase by Aspergillus awamori strain Vietnam Type Culture Collection (VTCC)-F099. Afr J Biotechnol 9: 6337-6344. Nguyen VT, Quyen DT (2010c) Purification and properties of a novel thermoactive endoglucanase from Aspergillus awamori VTCC-F099. AJBAS 4: 6211-6216. TRỊNH ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme cellulase 79 Ole K, Borchert TV, Fuglsang CC (2002) Industrial enzyme applications. Curr Opin Biotech 13: 345-351. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007a) Tinh sạch sơ bộ và đánh giá tính chất hoá lý của cellulase từ chủng PenicillUm sp. DTQ-HK1. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5: 47-54. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007b) Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng PenicillUm sp. DTQ-HK1. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5: 355-362. Người phản biện: TS. Trịnh Xuân Cư và ThS. Nguyễn Giang Phúc . ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme cellulase 71 KẾT QUẢ TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME CELLULASE TỪ CHỦNG NẤM SÒ PLEUROTUS SAIJOR-CAJU. với các enzyme kim loại, do đó cellulase của chủng P. saijor-caju có thể là một enzyme trong nhóm metalloenzyme. TRỊNH ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme. có những nghiên cứu về enzyme cellulase và ứng dụng enzyme này trong chăn nuôi và một số lĩnh vực khác. Năm 2007, Trịnh Đình Khá và cộng sự đã tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của enzyme cellulase,