Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng hệ thống nuôi cấy Bioreactor trong công nghệ sinh học thực vật
Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 1 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY BIOREACTOR TRONG CNSH THỰC VẬT 1. MỞ ĐẦU Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dể bị nhiễm. Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian và số lượng cây nhiều. Năm 1981, Takayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có hệ thống sục khí chủ động từ bên ngoài vào với tên gọi Bioreactor [2]. Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ra ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreactor, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ quan.[21] Và hệ thống Bioreactor là thường được dùng nhiều, chủ yếu để nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp trên nhiều đối tượng nghiên cứu khác nhau [22][2][18], và hiện nay đang có xu hướng dùng Bioreactor để nuôi cấy rễ lông tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp, bởi so với nuôi cấy huyền phù thì nuôi cấy rể có ưu thế là ít bị biến đổi di truyền và chứa nhiều sản phẩm cần thu nhận hơn. Nhưng thực ra từ những năm 60, Giáo sư Gamborg đã đưa ra ý tưởng ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong fermenter, vào những năm đó thiết bị nuôi cấy tương đương như hệ thống nuôi cấy lên men. Bằng thiết bị đó các nhà khoa học có thể điều khiển và xác định được sự tăng trưởng của tế bào. Sau khi bắt đầu nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng đã cho các nhà khoa học biết rằng tế bào thực vật khác với tế bào nấm men, và nếu được bảo quản trong điều kiện giống nhau thì tế bào thực vật không sinh trưởng đơn độc mà cũng không xảy ra sự sinh trưởng đồng thời theo một cách như tế bào nấm men. Nuôi cấy bằng kỹ thuật này, việc nghiên cứu thu nhận sinh khối, nghiên cứu dinh dưỡng và sinh hoá trong môi trường lỏng tỏ ra rất hiệu quả [4]. Trong những năm sau đó vào những năm 1970, một công ty Thuốc lá của Nhật Bản đã rất quan tâm đến vấn đề này, họ đã tiến hành sản xuất sinh khối cây thuốc lá để làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc điếu; công ty này đã nuôi cấy trong tank fermenter 20 lít [15]. Về sau, để khắc phục những nhược điểm của hệ thống cho ngập chìm mẫu hoàn toàn, Harris và Mason đã cải tiến thành hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary immersion system- TIS) là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống nuôi cấy Rocker vào năm 1983; ít lâu sau, vào năm 1985 Tesserat và Vandercook đã thiết kế một hệ thống nuôi cấy tự động APCS, đây là hệ thống có thể thây thế được môi trường và có thể sử dụng trong thời gian dài mà không cần cấy chuyền. Nuôi cấy bằng Bioreactor là Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 2 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều một trong những phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với số lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, chồi,…), và sản xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp bằng cách sử dụng tế bào thực vật. Mỗi hệ thống có những ưu nhược điểm riêng nhưng tất cả đều mang lại một số thành công bước đầu trong việc tạo ra một số sản phẩm. Trong những năm gần đây, hệ thống đã được phổ biến rộng, nhưng cũng chỉ mới ở các công ty đa quốc gia hoặc nghiên cứu cơ bản tại các phòng nghiệm và hệ thống này được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau như nhân giống cây trồng, y học… và đạt một số kết quả nhất định. Một công ty tai Đức, Diversa, đã trang bị đến năm hệ thống Bioreactor có dung tích đến 75.000 L để nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, những chi tiết cụ thể về hệ thống Bioreactor đó không được tiết lộ, theo hình ảnh trưng bày cho thấy hệ thống của họ có hình dáng trông giống hệ thống lên men vi khuẩn bình thường. Công ty đó đã nuôi cấy tế bào Echinacea purpurea ở quy mô lớn để sản xuất hợp chất có hoạt tính miễn dịch sinh học là polysaccharide.[15] 2. MỘT SỐ HỆ THỐNG BIOREACTOR 2.1. Cấu tạo chung Bioreactor là hệ thống có cấu tạo tương đối giống với hệ thống fermentor trong nuôi cấy vi sinh vật. Cấu trúc bên trong của Bioreactor cũng chứa các thành phần như bộ điều chỉnh nhiệt độ - pH, thùng chứa dung dịch dinh dưỡng, hệ thống cung cấp không khí, hệ thống cánh khuấy (trong một số thiết bị được thay bằng bộ sục khí nén từ dưới lên)… Nguyên tắc hoạt động của từng thiết bị phụ thuộc vào từng công nghệ sản xuất. Về sau, để tăng khả năng ứng dụng của hệ thống này trong nuôi cấy, người ta đã đưa ra một số mô hình cải tiến như các hệ thống ngập chìm tạm thời (TIS). Hệ thống này hoạt động trên nguyên tắc ngập chìm không hoàn toàn, mà được điều chỉnh thời gian ngập bằng tự động. 2.2. Phân loại Hệ thống Bioreactor có rất nhiều kiểu, nhưng trong giới hạn bài viết tôi chỉ đưa ra hai hệ thống nuôi cấy được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất là hệ thống Bioreactor kiểu Air-lift và hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời. 2.2.1. Bioreactor không có cánh khuấy Đây là kiểu Bioreactor đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bột khí ở phí dưới đáy bình, nó có tác dụng khuấy trộn môi trường và cung cấp oxygen và lượng oxygen cung cấp ảnh hưởng đến sự phát triển của đối tượng. Theo Hiroyuki Honda, callus của cây nho phát triển tốt nhất ở dòng khí cung cấp là 80 ml/phút, và góp phần làm tăng lượng anthocyanin trong nuôi cấy [11]. Loại này khắc phục được hai nhược điểm của Bioreactor có cánh khuấy là: ít ốn năng lượng cho khuấy trộn môi trường và ít gây ra lực xé rách các tế bào nhờ những dòng Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 3 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ dưới lên. Sự hòa trộn dòng khí vào pha lỏng trở nên hiệu quả hơn do có sự lưu trú các bong bóng khí trong môi trường [2]. Theo nghiên cứu của Paek và cộng sự (2003) trên đối tượng là các cây lâm nghiệp cho thấy, để có thể tạo được các bọt khí nhỏ mịn, dòng khí phải được thổi qua một màng lọc với những lỗ có kích thước nhỏ 0.01 – 0.1 mm. Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm giảm đáng kể sự cọ xát cho các tế bào nên tế bào ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có độ nhạy cảm cao [17] Ưu điểm của hệ thống này là có khả năng nhân sinh khối rất nhanh, khi nuôi ấy ngập chìm và được di chuyển tự do trong môi trường làm cho hiệu ứng ưu thế ngọn bị biến mất và chồi phát triển tương đối đồng đều. Hệ thống này rất phù hợp cho những quá trình nhân sinh khối tế bào và nhân sinh khối rễ do khả năng chịu được sự ngập chìm trong môi trường, và thực tế hiện nay người ta cũng đang sử dụng hệ thống này vào sản xuất giống hay sinh khối như nuôi củ hoa Lily, hoa thu Hải đường hay nhân sâm của phân viện sinh học Đà Lạt [2].Chính khả năng này đã thúc đẩy sự ứng dụng hệ thống Bioreactor vào nhân giống cũng như nhân nhanh sinh khối để thu các chất hoạt hóa sinh học. Tuy nhiên, Hệ thống Bioreactor Air-lift cũng lộ ra những khuyết điểm trong quá trình nuôi cấy như là dể bị hiện tượng thủy tinh thể hay hiện tượng street tế bào do mẫu khi nuôi cấy luôn được cho ngập chìm hoàn toàn và liên tục và hệ thống cũng khó áp dụng một cách đồng loạt cho nhiều giống khác nhau. Một vấn đề lớn nữa là nuôi cấy trong môi trường lỏng dể bị nhiểm vi sinh vật như nấm,vi khuẩn, côn trùng…Đó là những nguyên nhân mà hiện nay người ta đã có những cải tiến thiết bị trong nuôi cấy lỏng có cung cấp không khí từ bên ngoài [2] 2.2.2. Hệ thống nuối cấy ngập chìm tạm thời Hệ thống ngập chìm tạm thời gọi tắc là TIS, được nghiên cứu cải tiền vào năm 1985. Và nó được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu [23]. Ở nước ta, bước đầu Phân viện Sinh học Đà Lạt đã chế tạo hệ thống nuôi cấy này và đã thành công trong việc nhân giống nhanh loài hoa African violet. Kết quả cho thấy ỏn chuyờn mụn Cụng ngh T bo Thc vt GVHD: Hunh Vn Kit 4 SVTH: Hunh Phm Bo Triu h thng TIS cho hiu qu nhõn chi v tng sinh khi chi hoa African violet cao hn so vi phng phỏp nhõn ging truyn thng. C th l s chi tng 4,61 ln v sinh khi tng 23,17 ln [2] 2.2.2.1. Nguyờn tc v cu to Ngoi nhng h thng nuụi cy nghiờng, Rocker v h thng nuụi cy t ng APCS thỡ trờn th trng mt s h thng ó c thng mi húa nh: H thng RITA, h thng bỡnh ụi BIT v h thng Plantima. Vỡ õy thc ra l cỏc h thng c dựng nghiờn cu nc ta hin nay. Tt c cỏc h thng ny u tuõn theo nhng iu kin l trỏnh s ngp liờn tc, cú th thay i mụi trng, iu khin t ng v hn ch s nhim. V cu to h thng nuụi cy ngp chỡm tm thi gm cỏc b phn nh mỏy nộn khớ to ỏp lc hỳt mụi trng t ngn cha lờn ngn cha mu cy v ngc li, h thng ci t thi gian dựng iu khin chu k ngp, h thng ng dn v van iu khin, cỏc mng lc, bỡnh nuụi cy thng bng nha polycarbonate hay thy tinh. 2.2.2.1.1. H thng RITA H thng RITA (Hỡnh 1) l cụng trỡnh ca Teisson v Alvard vo nm 1995. Mt bỡnh cha 1 L gm cú hai phn, phn trờn cha mu cy v phn di cha mụi trng. Mt ỏp sut khớ dng c cung cp vo ngn di s y cht lng dõng lờn ngn cha mu cy. Mu cy c ngp chỡm trong mụi trng lng lõu hay mau tựy theo thi gian ỏp sut vt mc c duy trỡ. Trong sut thi gian ngp, khụng khớ c sc vo trong mụi trng lng, mụi trng c chuyn ng lm cho mu cy xoay tr c cỏc mt tip xỳc vi b mt mụi trng, ỏp sut vt mc sau ú c thoỏt ra bờn ngoi nh mt ngừ ra phớa trờn u h thng. V h thng ny th tớch mụi trng dinh dng c gi trong sut quỏ trỡnh nuụi cy m khụng cn phi thay mi. Hin nay, cú nhiu hóng sn xut h thng nuụi cy ngp chỡm tm thi RITA đ nh hóng Cirad, Phỏp; BITđ Twin Flask ca Cuba ó c kho sỏt v nghiờn cu trờn nhiu i tng khỏc nhau. Mt h thng cng xut hin gn õy l h thng Plantima đ Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 5 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều của công ty Atech, Ðài Loan. Hệ thống này cũng đã được tiến hành khảo sát trên nhiều đối tượng như chuối, hoa Lan… Hình 1: Pha 1:Mô không ngập trong môi trường Pha 2: Hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy. Pha 3: Sự trao đổi khí trong hệ thống Pha 4: Chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường và môi trường lỏng rút xuống ngăn dưới 2.2.2.1.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT Hệ thống bình sinh đôi BIT (Hình 2) được thiết kế bởi Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma. Ðối với nhân giống theo con đường phát sinh cơ quan kích thước mẫu cấy đòi hỏi một hệ thống có thể tích lớn hơn và rẻ hơn. Con đường dễ dàng nhất để đạt được trạng thái ngập chìm tạm thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ 250 mL - 10 L bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại. Hệ thống BIT ® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên. 2.2.2.1.3. Hệ thống Plantima Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc. Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan. Hệ thống này cũng đã được tiến hành khảo sát trên nhiều đối tượng như chuối, hoa Lan…Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 3, Hình 4): Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 6 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Hình 3: Các bộ phận chính của Plantima Hình 4: Hệ thống điều khiển chu kỳ ngập 2.2.2.2. Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời a. Ưu điểm - Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System) có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Như khả năng phát sinh chồi và phôi soma không bị biến dị với tần số cao. - Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thông thường. - Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn. - Nuôi trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm. Điều này được chứng minh thông qua việc trồng trực tiếp ra đất củ khoai tây bi và phôi soma cây cà phê. - Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã kết hợp thành công những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng. - Hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể so, đây là ưu điểm lớn của hệ thống này so với hệ thống Bioreactor thông thường. - Hệ thống này tiết kiệm được công lao động, không gian phòng nuôi cấy giảm số lượng chai lọ nên giảm được chi phí sản xuất, và hệ thống cho hiệu suất sinh học cao. Mô hình này rất thích hợp cho việc mở rộng quy mô phục vụ cho sản xuất thương mại. - Một ưu điểm khác của hệ thống này là trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 7 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều b. Khuyết điểm - Hiện nay chưa khảo sát được mật độ nuôi cấy [32] - Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới - Phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy - Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy - Giá thành của các thiết bị nuôi cấy ngập chìm tạm thời ở nước ta hiện nay rất đắt nhưng vẫn chưa được tự chế tạo trong nước. - Những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây 2.2.2.3. Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng cây nuôi cấy Theo nghiên cứu của Escalona và cộng sự (1999), cho thấy khi nuôi cấy chồi trong hệ thống TIS thì lá sẽ nhỏ hơn lá trong nuôi cấy lỏng [9]. Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong Bioreactor thường có hình cầu và chồi có xu hướng phát triển toả tròn xung quanh tâm. Do đó, một số chồi con có kích thước không lớn và cần được kéo dài trong cùng hệ thống trước khi cho ra rể ngoài ống nghiệm. Ngược lại, chồi cây có thân dài hơn và ra nhiều lá hơn khi nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời so với nuôi cấy trên thạch [24]. Chồi cây nuôi cấy trong hệ thống này cũng dài và nặng hơn chồi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình chứa dung tích lớn [4] 2.3. Các yếu tố và thông số ảnh hưởng đến quá trình nuối cấy Khác với nuôi cấy trên bề mặt thạch các thông số kỹ thuật hay các yếu tố ảnh hưởng chỉ là dinh dưỡng, pH, và độ vô trùng; thì đối với nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor thì có thêm các thông số như không khí, oxygen hòa tan, sự khuấy trộn và có thể có thêm yếu tố ngập chìm. Ở từng đối tượng cụ thể mà các thông số kỹ thuật có thể được điều chỉnh cho tối ưu. 2.3.1. Không khí Trong không khí thì thành phần các loại gồm Nitrogen (78%), Oxygen (21%) và Cacbon dioxide (0,036%). Lượng không khí trong bình phụ thuộc vào thể tích và độ Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 8 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều thoáng khí của bình. Hệ thống Bioreactor, hai yếu tố quan trọng là môi trường và độ thoáng khí.[3] Trong quá trình hô hấp thực vật sử dụng O 2 và thải CO 2 , còn trong quá trình quang hợp thì ngược lại. Trong pha tối, nồng độ CO 2 tăng lên trong nuôi cấy, còn khi điều kiện quang tự dưỡng chiếm ưu thế thì nồng độ đó giảm đi trong pha sáng. Nồng độ CO 2 cao có nhiều tác động có lợi trên sự kéo dài chồi và sự phát triển của lá cây Theobroma cacao [4]. Theo Woltering (1990), đã chứng minh được rằng nồng độ CO 2 trên 10.000 ppm rất có ích cho cây hoa Hồng và cây hoa Đồng tiền trong việc giảm lão hoá của lá. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy In vitro thì ngoài cơ chế trên thì cây còn thải ra trong bình nuôi cấy các chất khí như ethylen(C 2 H 4 ), ethanol(C 2 H 5 OH), acetaldehyde và hydrocacbon. Và theo nghiên cứu của De Proft và cộng sự (1985), thì trong điều kiện nuôi cấy In vitro thành phần môi trường khí khác nhau thì sự phát triển của cây cung khác nhau, cụ thể là là việc hàm lượng CO 2 giảm và hàm lượng ethylene tăng. Trong nuôi cấy dùng hệ thống Bioreactor thì cung cấp hay thải các chất khí đã được tính đến trong công nghệ của thiết bị nuôi cấy, và điều này có ý nghĩa rất lớn đến quá trình của mẫu cấy. Lấy trường hợp của củ khoai tây nuôi cấy bằng Bioreactor air-lift, khi chúng ta nuôi cấy chìm liên tục thì quá trình cảm ứng tạo củ bị ức chế và các củ chỉ phát triển sau khi các chồi được kéo dài ra và được tiếp xúc với pha khí ở phần trên của Bioreactor [4]. Các biện pháp tăng cường thêm lượng O 2 , điều khiển lượng hormone và các điều kiện thẩm thấu đều không có hiệu quả và khó giải thích được hiện tượng trên. Nhưng nếu thay bằng hình thức nuôi cấy 2 pha, môi trường có bổ sung 9% sucrose để cảm ứng tạo củ thì sự tạo củ từ chồi sẽ phát triển, vượt lên cả môi trường, tiếp xúc với pha khí ở phía trên. Ngoài ra, thì thoáng khí còn ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp, kết quả khảo nghiệm của các nhà nghiên cứu trên nhiều hệ thống nuôi cấy khác nhau cho thấy nếu sự thông thoáng càng nhiều thì chồi Hồ Điệp càng sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Điều này đã cho thấy tầm quan trọng của pha khí trong Bioreactor đối với sự phát triển của thực vật [2]. Một nghiên cứu đi vào khảo sát sự ảnh hưởng của sự thông thoáng đến sự phát triển của nuôi cấy huyền phù Catharanthus roseus trong hệ thống Bioreactor airlift của P. K. Hegarty và cộng sự cho thấy, khối lượng khô sau khi nuôi cấy có thể tăng lên rất nhiều và hàm lượng chất mang hoạt chất thứ cấp rất cao. Vì vậy trong nuôi cấy thì sự sinh trưởng và phát triển của cây không chỉ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy mà còn phụ thuộc vào thành phần không khí trong hệ thống nuôi cấy. 2.3.2. Oxygen hòa tan Một trong những chức năng của Bioreactor là tăng cường khả năng vận chuyển oxygen từ pha khí sang pha lỏng. Do oxygen chỉ hoà tan một phần trong nước (0.25 Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 9 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều mmol.l -1 ở 25 0 C, 1 atm) nên để đáp ứng nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô thực vật, một lượng lớn oxygen cần được khuếch tán vào môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, mức độ đảo trộn cũng là một yếu tố cần quan tâm do oxygen hòa tan trong môi trường cần nhanh chóng được mô và tế bào hấp thu. Tóm lại, đế đáp ứng tốt nhất nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô và tế bào thì lượng oxygen hòa tan trong dung dịch nuôi cấy luôn phải lớn hơn ngưỡng oxygen hòa tan cực đại mà tế bào mô hấp thu (DO 2 htcđ ). Trong trường hợp lượng oxygen hòa tan vào trong môi trường nhỏ hơn (DO 2 htcđ ), năng lượng ATP của tế bào sẽ bị giảm sút, từ đó ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát sinh hình thái và trao đổi chất của tế bào. Tuy nhiên, trong thực tế người ta căn cứ vào giá trị (DO 2 htcđ ) để thiết kế Bioreactor và giá trị này cũng là yếu tố được quan tâm hàng đầu khi tiến hành phóng đại hệ thống lên quy mô lớn hơn [2]. Theo nghiên cứu của Thanh N. T, Yu K. W, Hahn E. J. và Paek K Y(2005), cho thấy nồng độ Oxygen 40% là phù hợp cho việc sản xuất sinh khối và sản xuất Ginsenoside là tốt nhất, và nếu tăng lên 50% thì lại không thích hợp cho qua trình nuôi cấy tế bào cũng như tích luỹ sản phẩm Ginsenoside [25] 2.3.3. Sự đảo trộn Chỉ gặp ở các thiết bị Bioreactor dạng Air-lift. Thông số về đảo trộn là một yếu tố quan trọng khác vì nó phản ảnh mức độ đồng đều trong việc phân phối chất dinh dưỡng và mẫu cấy trong toàn bộ không gian nuôi cấy. Việc đảo trộn được thực hiện dưới những hình thức như sục khí, khuấy trộn cơ học hoặc kết hợp cả hai hình thức trên. Nó vừa làm tăng khả năng tiếp xúc của mẫu cấy với không khí vừa là biện pháp để cung cấp vào trong bình nuôi cấy. Ở một số trường hợp khi nuôi cấy mẫu trong Bioreactor thì nguồn oxygen thường không đến được với sinh khối ở giữa Bioreactor dẫn đến hậu quả là nhiều khối mô bị lão hóa, vì rể có nhiều nhánh nên nhiều rễ đan xen vào nhau có khả năng cản lại nguồn cung cấp khí cũng như dinh dưỡng cho các rể nằm phía trong; trường hợp này gặp ở nuôi cấy nhân sinh khối rể. Vì vậy mà khả năng thành công để làm nguồn cho sản xuất các chất có hoạt chất sinh học phụ thuộc vào việc thiết kế các hệ thống Bioreactor phù hợp. Tuy nhiên, cần lưu ý chỉ thực hiện quá trình khuấy trộn ở mức vừa phải để vừa kích thích mô, tế bào vừa không làm tổn thương mô tế bào. Sự đảo trộn trong nuôi cấy thì vẫn chưa được nghiên cứu nhiều, chỉ mới công bố ở mảng nuôi cấy tế bào thu nhận các sản phảm thứ cấp. Đối với các thiết bị nuôi cấy cải tiến thì sự đảo trộn thường ít được ứng dụng do các thiết bị này mẫu không bị ngập chìm hoàn toàn vào trong môi trường nuôi cấy. 2.3.4. pH pH là một thông số vật lý ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng phát triển của thực vật [2]. Theo một số tác giả, sự thay đổi độ pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 10 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều liên quan đến sự cân bằng của các muối amonium trong môi trường. Mức chịu đựng của thực vật đối với pH môi trường vào khoảng 5,5 đến 6,5; độ pH ảnh hưởng đến sự hoạt động của các nguyên tố đa vi lượng trong môi trường nuôi cấy. Dưới 5,5 thì khả năng hoạt động của P, K, Ca, Mg và Mo giảm đi rất nhanh, trên 6,5 thì Fe và Mn trở nên bất hoạt và nếu môi trường pH tăng quá cao sẽ diển ra sự kết tủa của Ca 3 (PO 4 ) [6] Theo Lazzeri P. A. và cộng sự (1987), khi pH hạ xuống dưới 5,0 thì mô thực vật sẽ bị ức chế một cách rõ rệt. [12] 2.3.5. Chất dinh dưỡng 2.3.5.1. Nguồn Cacbon Nuôi cấy trong Bioreactor cũng giống như nuôi cấy trên bất kỳ hệ thống nào thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn cacbon vào môi trường, tùy thuộc mục đích nuôi cấy mà có thể bổ sung thêm vào ở những nồng độ và liều lượng nhất định. Sucrose hoặc glucose ở tại nồng độ 2 -4 % thì phù hợp cho nguồn cacbon 2.3.5.2. Dinh dưỡng khoáng Có nhiều loại nguyên tố muối khoáng khác nhau cần cho đời sống thực vật được cung cấp dưới dạng đa lượng và vi lượng. Các nguyên tố đa lượng thường được sử dụng với nồng độ khá lớn (khoảng 0,5 mmol/l), còn các nguyên tố vi lượng được sử dụng với lượng rất nhỏ (khoảng 0,05 mmol/l) [5]. Nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor, các nhà khoa học thường sử dụng các loại môi trường khác nhau như SH, MS, B5, Nisch… nhưng môi trường được sử dụng nhiều vẫn là môi trường MS bởi đây là môi trường giàu khoáng, thích hợp cho nhiều đối tượng khác nhau. Trong một số nghiên cứu về sự hình thành củ trong nuôi cấy củ hoa Lily trong Bioreactor thì thu được kết quả sau 16 tuần nuôi cấy như các muối amonium, nitrate, phosphat hầu như được sử dụng hết, trong khi đó các ion K + , Mg 2+ , Ca 2+ , Na + , và Cl - vẫn còn một lượng đáng kể trong môi trường. Tuy nhiên một điều đặc biệt là đường sucrose lúc này lại là tác nhân ức chế sự tăng trưởng thay vì là một nguồn dinh dưỡng chính. Theo Y.E. Choi, nồng độ của NH 4 NO 3 trong nuôi cấy cây Panax ginseng để thu sinh khối thì ở từng giai đoạn là khác nhau, giai đoạn phát sinh callus thì nồng độ để cảm ứng callus là khoảng 60mM; trong khi đó, nồng độ khi cấy chuyền là 40mM; và dùng trong quá trình tăng sinh khối thì nồng độ chuẩn là 20 mM. [26]. 2.3.5.3. Chất điều hoà sinh trưởng Tái sinh chồi in vitro và quá trình nhân giống tiếp theo đòi hỏi nguồn cung cấp chất [...]... lượng saponin sẽ tăng sau 40 ngày nuôi cấy trong hệ thống Air-lift 20 L [14] Khi nghiên cứu sự phát triển sinh khối trong nuôi cấy huyền phù tế bào và nuôi cấy rể bất định cấy nhân sâm trong hệ thống Bioreactor, L Langhansova và cộng sự nhận thấy, khi nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hàm lượng Gingsenoside sẽ cao hơn nhiều so với nuôi cấy rể bất định Cụ thể là nuôi cấy dịch huyền phù hàm lượng Gingsenoside... khô, so với nuôi cấy rể bất định là 1,45 % [13] 3.2 Kết quả ứng dụng hệ thống bioreactor trong vi nhân giống vô tính thực vật 3.2.1 Trên đối tượng hoa Lily Năm 2005, tại Phân viện Sinh học Đà lạt đã nghiên cứu thành công nuôi cấy cây hoa lily trong hệ thống nuôi cấy Bioreactor Kết quả sau khi đưa ra ứng dụng cho thấy, có thể sản xuất hàng loạt củ giống hoa Lyli (cụ thể là trong một mẽ nuôi cấy đã tạo... vật 4 KẾT LUẬN Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào được cải tiến từ hệ thống Bioreactor nuôi cấy tế bào vi sinh Bioreactor với hệ thống cung cấy xả môi trường, hệ thống cấp và thoát khí vô trùng được thiết kế có khả năng tạo ra một môi trường nuôi cấy vô trùng, kiểm soát các yếu tố môi trường bên trong như sự lắc, sự thoáng khí, nhiệt độ, oxy hòa tan, pH… [33] Các ưu điểm của Bioreactor đã đưa... khi sử dụng hệ thống TIS trong quá trình nhân PLBs, cần khảo sát và tối ưu hóa các thông số về mật độ, thể tích và chu kỳ ngập chìm của hệ thống TIS Bảng 1: Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy đến sự tạo thành PLBs sau 2 tháng Hệ thống nuôi cấy Số PLBs Lỏng lắc 18,6 Thạch 16.4 TIS 23,4 Trên hệ thống TIS, từ một PLBs ban đầu rất nhiều cây được tái sinh cho lượng cây tái sinh vượt trội so với các hệ thống. .. đường (THĐ) Nuôi cấy Thu hải đường thông qua con đường nuôi cấy lát mỏng tế bào (TCL) thì khả năng nhân chồi khi nuôi cấy trong Bioreactor cao gấp 10 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch và 3 lần so với nuôi cấy lỏng tĩnh [16] Theo nghiên cứu của TS Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005), cho thấy sau khi nuôi cấy từ 4 – 6 tuần thì khả năng tăng sinh khối của cụm chồi Thu hải đường trong hệ thống Bioreactor. .. trì sự sống của củ Quan sát sự đóng mở khí khổng của lá nuôi cấy in vitro cho thấy củ nuôi cấy bằng hệ thống Bioreactor ít bị hiện tượng thủy tinh thể hơn so với nuối cấy lỏng tĩnh Như vậy, có thể khẳng định rằng hệ thống nuối cấy bằng Bioreactor thực sự rất hiệu quả trong nuôi cấy tăng sinh khối củ lily in vitro chỉ với thời gian 4 tuần nuôi cấy Điều này rất ý nghĩa trong nhân giống thương mại hoa... muốn ứng dụng rộng rải thì những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ở trong nước để giảm giá thành Ngoài ra, những thống số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lượng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì chúng ta mới co khả năng ứng dụng hệ thốngnayf một cách rộng rải trong sản xuất cây giống [32] Hệ thống nuôi. .. tạo bộ rễ khỏe mạnh trước khi ra vườn ươm Tóm lại khi nuôi cấy trong hệ thống TIS giúp cây phát triển nhanh và mạnh hơn những cây được nuôi cấy trong hệ thống kín thông thường giúp rút ngắn thời gian để cây đạt được kích thước để ra vườn ươm Tuy là thành công bước đầu nhưng hệ thống này cho thấy được những ưu điểm lớn so các hệ thống nuôi cấy truyền thống, và nó tạo ra một hướng đi mới cho CNSH Thực vật... chồi Thu hải đường trong hệ thống Bioreactor gấp 42 lần so với sinh khối của mẫu cấy ban đầu Trong khi đó, với các phương pháp nuôi cấy khác như nuôi cấy trên agar, sinh khối tắng cao nhất cũng chỉ đạt 6 lần; nuôi cấy lỏng tĩnh là 6,5 lần; nuôi cấy lỏng lắc là 23 lần Điều đó chứng tỏ khả năng to lớn của hệ thống nuôi cấy Bioreactor trong việc nhân số lượng lớn sinh khối thực vật Cũng trong nghiên cứu... rộng rải trong sản xuất cây giống [32] Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là một hệ thống không những tận dụng được các ưu điểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy trên thạch mà còn hạn chế được nhược điểm của hai hệ thống GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 18 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật nuôi cấy trên giúp tạo ra môi trường nuôi cấy thoáng khí, cây con khỏe mạnh, tỉ lệ sống sót . thành hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary immersion system- TIS) là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống nuôi cấy Rocker vào. hai hệ thống nuôi cấy được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất là hệ thống Bioreactor kiểu Air-lift và hệ thống nuôi cấy ngập