BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG  NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2015 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG  NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013 Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số: 62.72.01.15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai 2. PGS.TS. Trần Hải Anh HÀ NỘI – 2015 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận án này là công trình nghiên cứu nghiêm túc, trung thực. Tất cả số liệu và kết quả trong luận án chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Kim Phương iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn: - Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng - Ban Giám đốc, Trung tâm cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng - Ban Giám đốc Bệnh viện, Khoa Vi sinh vật – Bệnh viện TWQĐ 108 Đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới nhà khoa học PGS.TS.Lê Thị Quỳnh Mai ngƣời Thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi từ những bƣớc đi đầu tiên trong lĩnh vực vi rút học và luôn khuyến khích tôi tích cực nghiên cứu tiếp cận những kiến thức nâng cao để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Thầy PGS.TS.Trần Hải Anh đã sửa chữa chi tiết, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn Chủ nhiệm và các thành viên nghiên cứu trong đề tài cấp nhà nƣớc về Cúm A/H1N1/09 đại dịch (Mã số ĐTĐL2009G/55), Phòng Thí nghiệm Cúm Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của TS. Tsutomu Kageyama Trung tâm Cúm thuộc Viện Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, TS. Hoàng Vũ Mai Phương, ThS. Nguyễn Cơ Thạch, ThS. Lê Thị Thanh cùng các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng Thí nghiệm cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án. Tôi xin gửi đến mọi thành viên trong gia đình, những người thân yêu, những bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên chia sẻ về mọi mặt để tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình nghiên cứu đạt đƣợc thành quả ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 01 năm 2015 NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG iv MỤC LỤC Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii Danh mục các bảng ix Danh mục các hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ x ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I – TỔNG QUAN 3 1.1. Vi rút cúm 3 1.1.1. Đặc điểm vi rút học 3 1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A 10 1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09 13 1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới 13 1.2.2. Phản ứng của TCYTTG trƣớc diễn biến của đại dịch A/H1N1/09. . 19 1.2.3. Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam 20 1.2.4. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 21 1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 PTN 24 1.3.1. Phân lập vi rút. 24 1.3.2. Phƣơng pháp phát hiện vật liệu di truyền 26 1.3.3. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 30 1.4. Vắc xin 32 1.4.1. Các loại vắc xin cúm 33 1.4.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm 37 1.4.3. Phản ứng phụ của vắc xin cúm mùa và cúm đại dịch 38 Trang v 1.4.4. Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin 38 CHƢƠNG II – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 41 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 41 2.1.2 . Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09 41 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: 41 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: 41 2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 41 2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu 42 2.2.4. Các biến số nghiên cứu 42 2.2.5. Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm 43 2.2.6. Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao. 60 2.3. Vấn đề Y đức trong nghiên cứu 60 CHƢƠNG III – KẾT QUẢ 61 3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu. 61 3.2. Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen. 62 3.2.1. Đặc điểm di truyền gen HA(Haemagglutinin) 63 3.2.2. Đặc điểm di truyền gen NA(Neuraminidase). 69 3.2.3. Đặc điểm di truyền các gen M, NS, PB1 và PB2. 74 3.3. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 84 3.3.1. Kết quả thử nghiệm HI trên các vi rút phân lập trong nghiên cứu. 84 3.3.2. Phân bố sự thay đổi đặc tính kháng nguyên theo thời gian và các thay đổi axit amin trong protein HA liên quan. 85 3.4. Các đột biến liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên hoặc giảm độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir. 86 3.4.1. Phát hiện đột biến bằng phân tích trình tự nucleotide. 87 vi 3.4.2. Kết quả thử nghiệm sinh học đánh giá ảnh hƣởng của đột biến đến biểu hiện kiểu hình của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. 89 3.5. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin 90 3.6. Thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu (Haemagglutinin Assay –HA) 93 CHƢƠNG IV – BÀN LUẬN. 95 4.1. Sự lƣu hành của cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 -2013. 95 4.2. Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. 96 4.3. Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen 97 4.4. Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 98 4.5. Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1, PB2 101 4.5.1 . Protein HA 101 4.5.2 . Protein NA. 106 4.5.3 . Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2. 108 4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 109 4.7. Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI). 112 4.8. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin 113 KẾT LUẬN 118 KIẾN NGHỊ 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A(H1N1)pdm09 (Danh pháp chuẩn quốc tế) – A/H1N1/09 đại dịch (The novel influenza A(H1N1)vi rút which is causing of human influenza pandemic in 2009) ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit Ribonucleic CDC Centers for Disease Control (Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ) CPE Cytopathogenic effect (Gây hủy hoại tế bào) ELISA Enzyme-linked immunosorbent assays (Phản ứng hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới) GISRS Global Influenza Surveillance and Response System (Hệ thống giám sát cúm toàn cầu) HA Haemaglutinin HI Hemagglutinin Inhibition Assay (Phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu) IC 50 Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) IFA Immunofluorescent Assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang) ILI Influenza Like Illness (Bệnh giống cúm) IQR Interquartile Range (Khoảng tứ phân vị) ISIRV International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases (Hiệp hội quốc tế về bệnh cúm và các bệnh vi rút gây viêm đƣờng hô hấp khác) IVAC Institute of Vaccines And Medical Biological (Viện vắc xin và sinh phẩm Y tế, Nha trang) MDCK Mardin Darby Canin Kidney cell (Tế bào thận chó thƣờng trực) MN Microneutralization Assay (Phản ứng trung hoà vi lƣợng) NA Neuramindase NAI Neuraminidase Inhibition Assay ( Thử nghiệm ức chế enzyme Neuraminidase) NIBSC Nationnal Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm soát sinh học Vƣơng quốc Anh) viii NLS Nuclear Localization Signal (Tín hiệu định vị nhân) NP Nucleoprotein NS Non-structural OIE World Organisation for Animal Health (Tổ chức thú y thế giới) PA Polymerase acid PB Polymerase basic PCR Polymerase Chain Reaction (Phƣơng pháp khuếch đại gen) Polivac Viện nghiên cứu sản xuất vắc xin, Hà Nội RNP Ribonucleoprotein RT- PCR Reserve Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (Phƣơng pháp khuếch đại gen phiên mã ngƣợc) RT-LAMP Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (Phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngƣợc) SARS Severe Acute Respiratory Syndrome (Hội chứng hô hấp cấp tính nặng) Sequence Phƣơng pháp xác định trình tự gen VABIOTECH Company for vaccine and biologycal production No1 (Công ty TNHH một thành viên vắc xin và sinh phẩm số 1) WHO TCYTTG World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới PTN Phòng thí nghiệm ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm 8 Bảng 1.2 Diễn biến dịch liên quan đến phát hiện, kiểm soát hoạt động của trƣờng học trong giai đoạn A(H1N1)pdm09 tại Mexico 14 Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 42 Bảng 2.2 Bảng nhận định kết quả IC 50 của vi rút cúm 56 Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. ……61 Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phản ứng PCR 63 Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA 67 Bảng 3.4 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein HA 68 Bảng 3.5 Sự thay đổi (đột biến ) axit amin trên protein NA 72 Bảng 3.6 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein NA 73 Bảng 3.7 So sánh sự tƣơng đồng về axit amin trong các protein M1,M2, NS1, NS2, PB1 và PB2 của vi rút trong nghiên cứu 82 Bảng 3.8 Tần suất thay đổi axit amin thƣờng gặp trong protein 83 Bảng 3.9 Kết quả hiệu giá HI của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013. 84 Bảng 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian. 85 Bảng 3.11 Hiệu giá HI của các vi rút mang đột biến G155E và N156K. 89 Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm NAI với vi rút mang đột biến H275Y 90 Bảng 3.13 Kết quả lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin bằng đánh giá độ tƣơng đồng về di truyền học trên gen HA và NA. 91 Bảng 3.14 Độ tƣơng đồng nucleotide trong gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 nhóm 6C 92 Bảng 3.15 Kết quả HA và HI của các vi rút trong nhóm lựa chọn 93 Trang [...]... cao của vắc xin phòng bệnh [24], [39], [117] Để chủ động trong công tác phòng chống cúm đồng thời góp phần vào chiến lƣợc phát triển vắc xin cúm tại Vi t Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Vi t Nam, 2009 – 2013 với các mục tiêu: 1 Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Vi t Nam giai đoạn 2009. .. xuất hiện của đại dịch 1.1.1 Đặc điểm vi rút học 1.1.1.1 Phân loại Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: Vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa Trong đó vi rút cúm A, B, C gây bệnh cho ngƣời Vi rút cúm A lƣu hành phổ biến trên gia cầm, ngƣời và các động vật khác nhƣ lợn, ngựa là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu Vi rút cúm B thƣờng... 200 9- 2013 70 xi Hình 3.5 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của các nhóm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin 71 Hình 3.6 Cây gia hệ M của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 200 9- 2013 75 Hình 3.7 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 200 9- 2013 77 Hình 3.8 Cây gia hệ PB1 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09... sự cạnh tranh của vi rút cúm gây đại dịch H2N2 Đến năm 1977, vi rút này lại tái nổi trội và không có sự liên quan đến các vi rút cúm A ở các loài khác Đến năm 2009, vi rút cúm A/H1N1 mới đã xuất hiện và gây thành đại dịch cúm đầu tiên trong thế kỷ 21 [43], [80] 1.2.4.2 Chuẩn hóa thuật ngữ của vi rút cúm gây đại dịch năm 2009 Sau hơn 2 năm sau đại dịch cúm 2009, vi rút căn nguyên của đại dịch có rất nhiều... A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 200 9- 2013 79 Hình 3.9 Cây gia hệ PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 200 9- 2013 81 Hình 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian 86 Hình 3.11 Đột biến G155E, N156K và D222N trên protein HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 88 Hình 3.12 Đột biến H275Y trên protein NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm0988... đại phù hợp cho giải trình tự gen 62 Hình 3.2 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 200 9- 2013 65 Hình 3.3 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen HA của các nhóm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin A/California/07/09 (Mega 5 sofwave) 66 Hình 3.4 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 200 9- 2013. .. rõ ràng hơn khi nói đến vi rút cúm gây đại dịch năm 2009 Khi TCYTTG thông báo kết thúc đại dịch, vi rút cúm A/H1N1 gây đại dịch năm 2009 đã trở thành một vi rút cúm mùa tiếp tục lƣu hành cùng các vi rút cúm mùa khác (A/H3N2 và B) Tuy nhiên, danh pháp của vi rút này vẫn chƣa đƣợc chuẩn hóa dẫn đến vi c sử dụng rất nhiều tên cho cùng một vi rút Để giảm thiểu sự lẫn lộn trong khoa học, truyền thông và khẳng... hoạt động của vi rút cúm, một số đột biến xác định xảy ra trên gen PB2 có liên quan chặt chẽ với khả năng thích nghi của vi rút, điều này đặc biệt với vi rút cúm gia cầm H5N1 Vị trí 627 trên vi rút cúm ngƣời là Lysin trong khi trên vi rút cúm gia cầm là Glutamin, đột biến E627K trên vi rút cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút Trên gia cầm, vi rút tồn tại và nhân lên... đủ về vi rút học trong cơ chế gây đại dịch cúm ở ngƣời Tuy nhiên vi rút cúm này vẫn có xuất phát điểm là sự tiến hóa của vi rút cúm đại dịch H1N1/1918 [31], [42], [43] 23 Trong vòng 91 năm kể từ đại dịch 1918, vi rút cúm A/H1N1 luôn luôn lƣu hành trên gia cầm, lợn và ngƣời Sự lây truyền chéo giữa các loài đã xảy ra và kết quả là xảy ra một số vụ dịch nhỏ, lẻ tẻ Tuy nhiên sự vắng bóng của vi rút cúm. .. giai đoạn 2009 – 2013 2 Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 3 Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam 3 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1 Vi rút cúm Vi rút cúm là một vi rút đặc biệt trong nhóm vi rút gây bệnh đƣờng hô hấp cho ngƣời liên quan đến sự đa dạng về kháng nguyên, gây bệnh có tính chất mùa và ảnh hƣởng trên một phạm vi toàn cầu với . Nam, 200 9- 2013 75 Hình 3.7 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 200 9- 2013 77 Hình 3.8 Cây gia hệ PB1 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 200 9- 2013. nghiên cứu Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Vi t Nam, 2009 – 2013 với các mục tiêu: 1. Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. phạm vi toàn cầu với sự xuất hiện của đại dịch. 1.1.1. Đặc điểm vi rút học 1.1.1.1 Phân loại Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: Vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm