Đang tải... (xem toàn văn)
Powerpoint HPLC - MS TRONG AN TOÀN THỰC PHẨM tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất...
BÁO CÁO PP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI HPLC TRONG AN TOÀN THỰC PHẨM Phần dành cho đơn vị Nhóm 2: Bùi Thy Anh 2051778 Nguyễn Thị Thanh Loan 2051820 Đặng Minh Nhựt 2051838 Phạm Hoàng Ánh Phương 2051846 PHÂN TÍCH NITROFURAN BẰNG HPLC MS/MS 1.Giới thiệu chung: Nitrofuran la chất kháng sinh được dùng trong chăn nuôi và thủy sản. Hiện nay Nitrofuran bị cấm sử dụng do dư lượng của chúng có thể gây ung thư đối với người tiêu dùng. Nitrofuran có 4 chất chính : Furazolidone,Furaltadone, nitrofurazone, nitrofurantoin. Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp của Viện Kiểm soát Chất lượng sản phẩm nông nghiệp Hà lan (RIKILT). Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hoá nhóm nitrofuran trong sản phẩm thuỷ sản được thuỷ phân bằng axit clohyđric loãng để thu được mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này được dẫn xuất hoá bằng 2-nitrobenzalđehyt. Ðịnh tính và định lượng các chất dẫn xuất bằng LC/MS/MS bằng cách sử dụng các đồng vị đơtơri như chất chuẩn nội. Giới hạn phát hiện 1mg/kg 2. Nguyên tắc 3.Thiết bị, dụng cụ 1 Cân phân tích, độ chính xác 0,01 mg. 2 Cân phân tích, độ chính xác 0,01 g. 3 Máy nghiền 4 Máy ly tâm 5 Tủ ấm (có thể điều chỉnh được ở khoảng nhiệt độ 37oC 2oC) 6 Hệ thống cô bằng khí Nitơ 7 Máy lắc Vortex. 8 Màng lọc PTFE, 13mm, 0,45mm. 9 Giấy thử pH 10 Pipet 100ml 11 Hệ thống LC/MS/MS: - Hệ thống sắc kí lỏng: Water Alliance 2690 hoặc tương đương gồm bơm và hệ thống tiêm mẫu; - Cột bảo vệ pha đảo C18 (Symmetry Sentry Guard hoặc tương đương), kích thước 20 x 3,9mm; - Cột C18 (Symmetry hoặc tương đương) kích thước150 x 3,0 mm, 5mm, - Ðầu dò khối phổ dạng bốn cực với giao diện ESI (Triple quadrupole Micromass Quattro Ultima hoặc tương đương). 12 ống ly tâm 14ml, polypropylen hoặc thuỷ tinh, có nắp đậy 13 Máy lắc ống nghiệm 14 Lọ đựng mẫu cho HPLC 15 Bình định mức 10ml, 20ml, 100ml 16 Dụng cụ thủy tinh thông thường. 17 Máy lắc đảo đầu (Heidolf REAX2) hoặc tương đương Hóa chất và Chất chuẩn Hóa chất • Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích gồm: • 1 Metanol • 2 Axit clohydric (HCl) 32%. • 3 2-nitrobenzalđehyt (C7H5NO3) viết tắt làNBA. • 4 Natri phosphat ngậm nước Na3PO4.12H2O. • 5 Natri hyđroxyt khan (NaOH). • 6 Etyl axetat (CH3COOC2H5). • 7 Axit axetic (CH3 COOH). • 8 Axetonitril (CH3CN). • 9 Metanol -d, 99,5% D. 5.2.10 Nước Chất chuẩn • 1 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ). • 2 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon (AMOZ). • 3 1-amino-hyđantoin hyđroclorit (AHD). • 4 Semicarbazit (SEM) hyđroclorit. • 5 3-amino-2- oxazolidinon-d4 hyđroclorit (AOZ-d4). • 6 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon-d5 (AMOZ-d5). • 7 1-amino-hyđantoin hyđroclorit-d2 (AHD-d2). • 8 3-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-2-oxazolidinon (NPAOZ). • 9 5-metylmorfolino-3-((2-nitrophenyl)metylen)-3-amino-2-oxazolidinon (NPAMOZ). • 10 1-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-hyđantoin (NPAHD). • 11 (2-nitrophenyl) metylen-semicarbazit (NPSEM). CÁCH TIẾN HÀNH Chuẩn bị các dung dich và mẫu Xử lý mẫu Chạy máy sắc ký Xử lý kết quả Chuẩn bị các dung dịch • Axit clohyđric 0,2M • 2-nitrobenzalđehyt (NBA) 100mM trong metanol nồng độ 0,1M • Natri phosphat 0,3M • Dung môi hoà tan mẫu: trộn 50ml axetonitril (5.2.8), 450 ml nước (5.2.10) và 0,5 ml axit axetic • Pha động A: trộn 1ml axit axetic đã chuẩn bị với 1000ml nước lọc qua màng lọc 0,45mm. • Pha động B: trộn 900ml axetonitril với 100ml nước và 1ml axit axetic lọc qua màng lọc 0,45mm Chuẩn bị các dd chuẩn Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu • Mẫu thử nghiệm. • Mẫu kiểm soát chất lượng • Mẫu kiểm soát âm tính: mẫu trắng không chứa AOZ, AMOZ, AHD và SEM • Mẫu kiểm soát dương tính: mẫu trắng được bổ sung AOZ, AMOZ, AHD và SEM Xử lý mẫu: Vì các chất dẫn xuất nitrophenyl rất nhậy với ánh sáng nên toàn bộ qui trình xử lý mẫu phải được tiến hành dưới ánh sáng yếu (ánh sáng vàng). 1 Thuỷ phân và dẫn xuất hoá mẫu:5 ml axit clohyđric 0,2M + 50ml dung dịch 2-NBA trong metanol giữ qua đêm hiệt độ 372oC. 2. Trung hoà :500 ml dung dịch Na3PO4 0,3M vào mẫu. Lắc mẫu bằng tay. Ðiều chỉnh pH về 7+-0,5 bằng dd NaOH 2M. 3. Chiết Thêm 4ml etyl axetat vào mẫu đã điều chỉnh pH 4. Chuẩn bị mẫu phân tích :Hoà tan cặn khô bằng 500ml dung môi hoà tan mẫu 5. Phân tích trên LC/MS/MS 6. a. Tốc độ: 0,4 ml/phút; b. Thể tích mẫu tiêm: 50 ml; c. Nhiệt độ cột: 40oC; d. Toàn bộ thời gian phân tích: 22 phút; đ. Pha động: chế độ gradien theo Bảng 2 Thời gian (phút) Pha động A Pha động B 0 90 10 1 90 10 14 55 45 16 10 90 18 10 90 19 90 10 Điều kiện đầu dò MS và MS/MS 6.2.5.2 Ðiều kiện của đầu dò MS • a. Tỉ số chia: xấp xỉ 1 : 2 • b. Kiểu ion hoá: ESI, dương • c. Ðiện thế mao quản: 2,7 kv • d. Ðiện thế khối nón: 30 v • đ. Nhiệt độ nguồn: 120oC • e. Nhiệt độ khử dung môi: 300oC • g. Tốc độ dòng khí khử dung môi: 500 l/h • h. Tốc độ khí qua khối nón: 200 l/h • i. Khí gây phân ly bằng va chạm: Argon, p = 3,2.10-3 bar. 6.2.5.3 Ðiều kiện phân ly MS/MS NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD và NPSEM bị phân ly thành các ion thứ cấp liên quan đến cấu trúc. Các chất đồng vị đánh dấu được sử dụng làm chất chuẩn nội cũng có cách phân ly tương tự (Bảng 3). [...]... Acetonitrile Diethyl ether Ethyl acetate Hexane Carbon tetrachloride CAP standard (độ tinh khiết>99%) d5-CAP (độ tinh khiết >98%) • MS- MS detection : CAP và -d5-CAP đầu tiên được phân tích bằng ESI -MS Phổ khối lượng của CAP Phổ khối lượng của d5-CAP • Cả CAP và -d5-CAP sau đó được phân tích bằng HPLC- ESI -MS- MS với quá trình anion hóa bằng cách chọn 2 số khối m/z 321 và m/z 326 là những ion báo trước... nghiệm có 6 mẫu Độ thu hồi của CAP từ những mẫu được thêm vào 0. 1- 0.45 nằm trong khoảng 8 6-9 2% KẾT LUẬN Phương pháp HPLC/ MS- MS giới thiệu ở trên là một phương pháp tương đối nhanh chóng và nhạy trong việc kiểm tra dư lượng CAP, bảo vệ người tiêu dùng khỏi những sản phẩm bị nhiễm CAP Ngày nay, CAP được xác định bằng phương pháp xét nghiệm nhanh GICA ... HPLC với đầu dò huỳnh quang Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ 5-1 0 µm Nước cất, Metanol, Clorofom, Axetonitril, n-hexan Ete etylic tinh khiết loại dùng cho HPLC Silicagel đã được hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết để vào tủ sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ 110oC Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong clorofom 15 phút... lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được Với đường chuẩn ở dạng y = ax +b, hàm lượng các aflatoxin được tính theo công thức sau (Y - b) C (µg/kg) = xF a Trong đó: - C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu, tính theo µg/kg - Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b là các thông... mẫu • Quy trình hoàn chỉnh về trích ly và làm sạch dư lượng CAP trong sữa : 10ml Nước sạch + 10g mẫu sữa Ly tâm trong 20 phút 3ml 6ml ethyl acetate + 1ml d-5-CAP (0.6ng/ml) Lắc trong 45 phút, tách pha Lấy 4ml của lớp trên (ethyl acetate), cô cho đến khô ở 500C bằng dòng khí nitơ Hòa tan vào 0.5ml nước, sau đó trích với 0.5ml hỗn hợp Ly tâm trong 5 phút với vận tốc 25000 vòng/phút Tách lớp nước, lấy 20... tính • i Mẫu kiểm soát dương tính TÍNH TOÁN KẾT QUẢ • Tính lượng chất cần phân tích có mặt trong mẫu kiểm theo công thức sau: RF – b X = -a - X là lượng chất cần phân tích có trong mẫu kiểm (mg/kg) (*) - RF là hệ số tín hiệu (công thức 5) - b là độ dựng của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến tính - a là độ dốc của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến tính (**) Phương pháp định... mẫu thực phẩm bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom Dịch chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,5 µg/kg 3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn và dung dịch thử Hệ thống HPLC. .. vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V và khối lượng mẫu m sử dụng PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHLORAMPHENICOL TRONG SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP – PHỔ KHỐI LƯỢNG (HPLC/ MS- MS) NỘI DUNG • GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC • TRÌNH BÀY PHƯƠNG PHÁP • KẾT LUẬN GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC... Waters Alliance 2695 separations module (Waters, Milford,MA,USA) Electrospray Interface (ESI) Quattro Ultima Pt Micromass mass Spectrometer (Wythenshawe,UK) Column temp : 300C Mobile phase : Water- Acetonitrile gradient (CH3-CN tăng từ 20 %- 60% trong 4 phút) Flow rate : 0.2 ml/phút Sample volume : 20 micro lít Hóa chất : Purified water Acetonitrile Diethyl ether Ethyl acetate Hexane Carbon... thực phẩm như : Đậu phộng, càfe, sữa, tương , chao bắp và các loại ngũ cốc khác Dựa trên đặc tính lý hóa và tính độc khác nhau các Aflatoxin được chia thành nhiều nhóm : B ( B1 , B2); G (G1, G2); M (M1, M2); P1 và Q1 Aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây ung thư gan ở người và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang thai và còn có nhiều tác hại nguy hiểm khác 2 Nguyên tắc Aflatoxin có trong . 5 3-amino- 2- oxazolidinon-d4 hyđroclorit (AOZ-d4). • 6 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon-d5 (AMOZ-d5). • 7 1-amino-hyđantoin hyđroclorit-d2 (AHD-d2). • 8 3-( (2-nitrophenyl)metylen)-amino-2-oxazolidinon. 3-( (2-nitrophenyl)metylen)-amino-2-oxazolidinon (NPAOZ). • 9 5-metylmorfolino- 3-( (2-nitrophenyl)metylen )-3 -amino-2-oxazolidinon (NPAMOZ). • 10 1-( (2-nitrophenyl)metylen)-amino-hyđantoin (NPAHD). • 11 (2-nitrophenyl). Axetonitril (CH3CN). • 9 Metanol -d, 99,5% D. 5.2.10 Nước Chất chuẩn • 1 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ). • 2 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon (AMOZ). • 3 1-amino-hyđantoin hyđroclorit (AHD). •