Đang tải... (xem toàn văn)
tài liệu chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn
Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1. Giới thiệu Chuyển nạp gen (gene transformation) là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào genome cây trồng. Công nghệ gen thực vật diễn biến nỗi bật qua các móc thời gian tạo ra những bước tiến ngày càng xa và khả năng ứng dụng cũng tăng theo: Năm Những phát triển quan trọng 1980 Lần đầu tiên chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens 1983 Marker chọn lọc, Ti-plasmid được loại bỏ các gen không cần thiết 1984 Biến nạp vào tế bào trần 1985 Kháng thuốc trừ cỏ 1986 Kháng virus Lần đầu tiên đưa cây biến đổi gen ra đồng ruộng 1987 Kháng côn trùng Biến nạp phi sinh học 1988 Điều khiển sự chín ở cà chua 1989 Kháng thể ở thực vật bậc cao 1990 Biến nạp phi sinh học ở ngô Tính bất dục đực nhân tạo 1991 Thay đổi thành phần carbohydrate Tạo alkaloid tốt hơn 1992 Thay đổi acid béo Biến nạp phi sinh học ở lúa mỳ Lần đầu tiên phân giải plastic nhờ cây biến đổi gen Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất hiện trên thị trường 1994 Lần đầu tiên hơn 10 gen được chuyển đồng thời vào thực vật 1998 Trên thế giới có 48 trong đó Mỹ có 35 loại thực vật biến đổi gen được thị trường hóa Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt hơn Cây biến đổi gen được trồng trên diện tích hơn 40 triệu ha 1999 Cho đến nay khoảng 9000 thí nghiệm về cây biến đổi gen được đưa ra đồng ruộng (ở EU: 1360) Thành tựu kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp AND cho phép người ta thực hiện chuyển gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới. Cây được chuyển nạp gen mục tiêu được gọi là cây “transgenic”, với hai phương pháp chuyển nạp gen: (1) chuyển nạp gen gián tiếp nhờ sự cải tiến không ngừng hệ thống Ti-plasmid trên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, và (2) chuyển gen trực tiếp theo phương pháp PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp mỡ lỗ bằng điện (electroporation), phương pháp bắn gen (biolistic), phương pháp chuyển qua ống hạt phấn (pollen tube pathway) và một và kỹ thuật khác. Trong đó ba phương pháp được ứng dụng rộng rãi là chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens , tế bào trần và phi sinh học. 2. Chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh ghẻ khối u trên cây, phát sinh ung thư, tạo ra kết quả trực tiếp hình thành khối u để tổng hợp ra một loại dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển. Gen Agrobacterium là nhóm genus có tính chất sinh sản trong đất, gram âm, cùng họ với Rhizobium. Có bốn species đã được ghi nhận. Agrobacterium tumefaciens tạo ra khối u trong tế bào tumor chưa được phân hóa và chưa được tổ chức. một vài dòng của Agrobacterium tumefaciens không tạo khối u nhưng kích thích sự tăng trưởng của teratomas (thẻ dị thường, khác thường). tuy nhiên thực vật thuộc đơn tử diệp tỏ ra kháng đối với Agrobacterium, chỉ trừ một vài loài của Asparagus. Đặc điểm quan trọng của tế bào khối u là tăng trưởng không cần kích tố thực vật trong môi trường nuôi cấy mô. Điều này ngược lại với tế bào cây bình thường, do cần phải bổ sung auxin, cytokinin để duy trì sự tăng trưởng và sự sống trong nuôi cấy. Sự tăng trưởng không phụ thuộc vào hormon của tế bào khối u bị kích thích bởi Agrobacterium gợi cho chúng ta một ý tưởng: sẽ có sự thay đổi hàm lượng hormon nội sinh. Sự thay đổi mức biến dạng dị hình này trong cơ quan bi biến dạng dị hình được ghi nhận. Những khối u này là không gian sống của vi khuẩn, một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn được tạo ra, đây cũng chính là đặc tính của tế bào khối u. Trong mô bình thường không có hình thành nhóm hóa học này. Những opine phổ biến là nopalin và octopin.Về mặt hóa học opine là sản phẩm ngưng tụ của aminoacid với cetoacide hoặc aminoacide với đường. Octopin được tạo nên từ amino acid là arginine và pyruvate, còn nopalin được tạo nên từ arginine và -cetoglutaraldehyd. Công thức cấu tạo của opine được trình bày ở hình 1.1. Khả năng chuyển DNA của Agrobacterium tumefaciens được sử dụng trong công nghiệp gen hiện đại. Để được quá trình này điều cần thiết là phải làm rõ sự tương tác giữa Agrobacterium với thực vật. COOH COOH COOH COOH HC NH CH HC CH CH CH 2 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COOH NH NH C C H2N NH H2N NH Octopin Nopalin Hình 1.1 Công thức cấu tạo của opine. 2.1 Ti – plasmid Chức năng của plasmid đã được ghi trên bản đồ là khả năng của nhiều dòng khác nhau. Agrobacterium tumefaciens kích thích tạo khối u để tổng hợp các opine. Ti-plasmid thể hiện tính chất chuyên biệt đối với một opine nào đó mà thôi. Thí dụ Ti-plasmid của dòng C58 Agrobacterium tumefaciens mã hóa đối với nopaline và dị hóa nopaline nhưng không phân giải được octopine, nó được xếp vào nhóm plasmid có dạng nopaline. Việc sử dụng A. tumefaciens đã bắt đầu từ 1907, khi người ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị thương, được gọi là khối u cổ rễ (Hình 1.2). Trong những năm bảy mươi người ta tìm thấy trong các chủng A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn có kích thước 200 đến 800 kb. Qua những thí nghiệm chuyển đến những chủng không độc (không có plasmid này), đã khẳng định plasmid này cần thiết cho việc tạo khối u. Vì vậy, plasmid này được gọi là Ti-plasmid (tumor inducing-plasmid). Ti-plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết những tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoạn được gọi là T-DNA. T- DNA là một phần của Ti-plasmid, được chuyển vào thực vật (transfer-DNA). Trên đó định vị những gen tạo khối u và tổng hợp opine. T-DNA được giới hạn bởi hai vùng, bờ trái và bờ phải (LB : left border và RB: right border). Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA. Hình 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. a: Dưới kính hiển vi điện tử. b: Khối u ở cây và từ khối u này xuất hiện chồi một cách tự nhiên. Một số loài vi khuẩn A.tumefaciens chứa Ti-plasmid của loại octopin và loại khác của nopalin. Một sự khác biệt khác của các loại plasmid ở Agrobacterium là Ti-plasmid của loại nopalin chứa một bản copy của T-DNA, ngược lại pasmid octopin chứa ba. 2.2 Chức năng của T-DNA Phân tích di truyền và ứng dụng kỹ thuật lập bản đồ liên kết gen cho phép chúng ta hiểu được chức năng của vùng mang T-DNA, vùng này được thể hiện theo sự liên hợp nhất. T-DNA được đưa vào DNA thực vật trong nhân tế bào. Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả năng sao chép. Sự tổng hợp opine được điều khiển bởi T-DNA. Những enzime như: octopine synthase, nopaline synthase được mã hóa trên T-DNA tại những loci: osc và nos theo thứ tự. có những vùng của T-DNA khá quen thuộc với cả hai plasmid: octopine và nopaline. 2.3 Qua trình chuyển nạp Quá trình lây nhiễm được mô tả ở hình 1.3. Khối u được tạo nên là do phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa. Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bị thương. Khi tế bào bị thương chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringon), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và sự gắn kết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật. Bị thương Nhiễm sắc thể của vi khuẩn Ti-plasmid với T-DNA Agrobacterium Nhiễm sắc thể trong nhân tế bào thực vật Agrobacterium Tế bào thực vật Agrobacterium trong khối u Agrobacterium trong khối u T-DNA của vi khuẩn trong DNA nhân của tế bào thực vật Cơ chế nhận biết được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A.tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm thì phản ứng này chỉ ở một ít loài. Vì vậy, Agrobacterium được sử dụng giới hạn cho biến nạp cây một lá mầm. Khi bổ sung syringon người ta có thể biến nạp nấm bằng A. tumefaciens. Thực vật một lá mầm quan trọng như ngô có thể được biến nạp bằng A. tumefaciens. Tms tmr nos RB noc tra ori vir T-DNA LB Hình 1.3. Sơ đồ lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hình 1.4.Ti-Plasmid của Agrobacterium dạng nopalin. T-DNA: Transfer-DNA, LB: Bờ trái. RB: Bờ phải, ori: khởi đầu sao chép của A. tumefaciens. noc: Phân giải nopalin, nos: Tổng hợp nopalin. tmr: Tổng hợp cytokinin, tms: Tổng hợp auxin, tra: Vận chuyển tiếp hợp, vir: Vùng virulence (vùng độc tính). Sự phát triển khối u sau khi nhiễm A. tumefaciens dựa trên tác dụng của hai phytohormone. Các enzyme cần thiết cho tổng hợp phytohormone được mã hóa chủ yếu từ những gen trên T-DNA. Sự tổng hợp auxin được thực hiện bởi hai gen là tms1 và tms2. Gen tms1 mã hóa tryptophan-2- monooxygenase xúc tác cho sự biến đổi tryptophan thành indol-3-aceamid. Sản phẩm của gen tms2 là indol-3- acetamid-hydrogenase, xúc tác để tạo ra auxin: indolylacetic acid. Ngoài ra T-DNA còn mang gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase. Enzyme này gắn 5’-AMP vào chuỗi bên isoprenoid để tổng hợp nên tiền cytokinin là isopentenyladenin và isopentenyladenosin. Hydroxyl hóa tiền cytokinin bằng những enzyme thực vật để tạo nên cytokinin. Auxin được tạo nên cùng với cytokinin làm cho khối u lớn lên, trong đó sự phân chia tế bào không phân hóa được kích thích. A. tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ một chất nhận, được mã hóa bằng một gen ở vùng vir. Sự nhận biết bằng chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen vir. Vùng vir bao gồm nhiều gen. Một sản phẩm gen vir khác là một endonuclease nhận biết bờ phải và trái của T-DNA và cắt T- DNA ở những vị trí này. Sau đó, một protein gắn vào sợi đơn của T-DNA và phức hệ này được chuyển vào thực vật dưới tác dụng của các sản phẩm gen vir (Hình 1.6). LB RB T-DNA RB RB LB virD2 . bằng một gen ở vùng vir. Sự nhận biết bằng chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen vir. Vùng vir bao gồm nhiều gen. Một sản phẩm gen vir khác là. Chuyển gen thực vật bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1. Giới thiệu Chuyển nạp gen (gene transformation) là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào genome