CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (SH3014) 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Các phương pháp lai phân tử  Phương pháp PCR, ứng dụng  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 2 BM CNSH TV – Khoa CNSH Kiến thức ôn tập • Cấu trúc phân tử DNA 3 Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ Purines Pyrimidines 4 [structure of deoxyadenosine] Nucleoside Nucleotide 5 ii). Structure of the DNA double helix 6 5’ 3’ Cấu trúc của chuỗi DNA polynucleotide 7 DNA  RNA  Protein  Function Học thuyết trung tâm “The Central Dogma” Transcription Replication Translation Work 8 Phân loại Gene coding genes non-coding genes Messenger RNA Proteins Structural RNA Structural proteins Enzymes transfer RNA ribosomal RNA other RNA Chromosome (simplified) intergenic region 9 2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE)  Khái niệm: là các endonuclease có khả năng nhận dạng và cắt DNA ở những vị trí đặc hiệu. – Restriction enzymes = Restriction endonuclease Endo (bên trong), nuclease (cắt nucleic acid) – Trình tự nhận biết của RE được gọi là trình tự giới hạn 10 BM CNSH TV – Khoa CNSH  Ví dụ: trình tự nhận biết của EcoRI [...]... cắt 3’ overhangs BM CNSH TV – Khoa CNSH Tạo đầu bằng blunt ends Tạo đầu sole 5’ overhangs 18 Ví dụ một số RE loại II BM CNSH TV – Khoa CNSH 19 Ứng dụng của RE loại II trong công nghệ gen • Tạo DNA tái tổ hợp • Lập bản đồ giới hạn BM CNSH TV – Khoa CNSH 20 Tạo DNA tái tổ hợp • DNA tái tổ hợp là các DNA được tạo thành từ ít nhất hai đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau thông qua vi thao tác của con người • Nếu... enzyme thì các đầu cắt của các đoạn DNA được tạo ra hoàn toàn khớp nhau (tương ứng theo quy tắc bổ sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym ligase Từ đây xuất hiện khả năng ghép nối các DNA có nguồn gốc khác nhau để tạo nên DNA tái tổ hợp Ligase BM CNSH TV – Khoa CNSH 21 Bản đồ giới hạn • Là bản đồ thể hiện loại enzyme giới hạn, số lượng và kích thước các đoạn... thời tự methyl hoá DNA của tế bào chủ để tự bảo vệ BM CNSH TV – Khoa CNSH 11 Restriction Endonucleases Tại sao DNA của vi khuẩn không bị phá hủy bởi chính các enzyme cắt giới hạn của chúng? 12 Sự Methyl hóa (Methylation) 13 Phân loại các RE • Loại I: cắt tại điểm cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotide • Loại II: cắt ngay tại vị trí giới hạn • Loại III: cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó... sinned BM CNSH TV – Khoa CNSH 16 Tần suất cắt Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫu nhiên thì xác suất để một đoạn trình tự đƣợc nhận biết sẽ là 1/4n (n là chiều dài (bp) của chuỗi đƣợc nhận biết) Số nucleotide của đoạn nhận biết Xác suất xảy ra sự kiện phân cắt bởi RE 4 1/ 44= 1/256 5 1/ 45= 1/ 1024 6 1/ 46= 1/ 4096 8 1/ 48= 1/ 65.536 n 1/ 4n BM CNSH TV – Khoa CNSH 17 Các kiểu cắt... Loại III: cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó khoảng 20 nucleotide BM CNSH TV – Khoa CNSH 14 Cách gọi tên Genus (Tên chi) Ví dụ: EcoRI Escherichia Species (Tên loài) coli Strain (Chủng) R Thứ tự tìm ra enzyme I (số La Mã) BM CNSH TV – Khoa CNSH 15 Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II Trục đối xứng Trình tự nhận biết là các palindrome Đây là đoạn DNA mạch kép, 2 mạch bổ sung có trình tự giống... dụng các loại enzyme khác nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau • Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự khác nhau giữa các cá thể trong loài BM CNSH TV – Khoa CNSH 22 Phƣơng pháp lập bản đồ giới hạn • Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu và thực hiện PCR tạo ra một lượng DNA cần thiết • Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý enzym giới hạn các mẫu...Lịch sử phát hiện • 1950s: một số dòng vi khuẩn có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của một số bacteriophages • 1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của phage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bản thân để tránh bị phá huỷ • 1970s: Haminton Smith (Johns Hopkins University), Phát hiện được enzyme HindII từ Haemophilus... sự xuất hiện lại đoạn 6kb và 8kb, hai đoạn này là sản phẩm của sự hoạt động của enzym 1 Như vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi enzym 2 (vỡ kết quả cắt phối hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb, 1 kb) Từ đây suy ra đoạn 3kb phải nằm ở giữa sợi 24 Restriction enzyme animation http://www.dnai.org/b/index.html 25 Bµi tËp Nhân dòng một đoạn DNA có chiều dài 900 bp sau đó phân cắt với 3 enzyme, chạy điện di cho các kết... thiết • Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý enzym giới hạn các mẫu trong điều kiện thích hợp • Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang DNA chuẩn, tính toán kết quả và lập bản đồ BM CNSH TV – Khoa CNSH 23 VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn DNA nghiên cứu (kích thước 17kb) Kết quả cho 3 đoạn DNA (6kb, 3kb, 8kb) Điều này chứng tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên đoạn ADN... 25 Bµi tËp Nhân dòng một đoạn DNA có chiều dài 900 bp sau đó phân cắt với 3 enzyme, chạy điện di cho các kết quả sau đây: Enzyme EcoRI HindIII BamHI EcoRI + HindIII EcoRI + BamHI HindIII + BamHI Độ lớn các đoạn phân cắt (bp) 200, 700 300,600 50,350,500 100,200,600 50,150,200,500 50,100,250,500 Hãy vẽ bản đồ giới hạn từ những số liệu trên? 26 . CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (SH3014) 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)  Chức năng và ứng dụng của. CNSH TV – Khoa CNSH • Tạo DNA tái tổ hợp • Lập bản đồ giới hạn 20 Ứng dụng của RE loại II trong công nghệ gen BM CNSH TV – Khoa CNSH . the DNA double helix 6 5’ 3’ Cấu trúc của chuỗi DNA polynucleotide 7 DNA  RNA  Protein  Function Học thuyết trung tâm “The Central Dogma” Transcription Replication Translation Work 8 Phân loại