CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (SH3014) Giảng viên hướng dẫn: …… BM CNSH TV – Khoa CNSH CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) Chức ứng dụng enzyme giới hạn Giới thiệu vector nhân dòng kỹ thuật nhân dòng gen Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome cDNA BM CNSH TV – Khoa CNSH PCR Polymerase Chain Reaction Sự phát minh kỹ thuật PCR • Kỹ thuật PCR hay cịn gọi phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase Kary Mullis phát minh vào năm 1983 • Hai năm sau (1985), phát minh thức cơng bố tạp chí khoa học quốc tế • Với cơng trình này, Kary Mullis tặng giải thưởng Nobel hóa học năm 1993 “Sự phát minh kỹ thuật xứng đáng coi bước ngoặt hay kỹ thuật mang tính cách mạng thúc đẩy phát triển Công nghệ sinh học đại” (J Watson) Khái niệm Kỹ thuật PCR phương pháp cho phép nhân nhanh số lượng lớn đoạn DNA Phương pháp có độ nhạy cao ngày trở thành công cụ nghiên cứu đầu tay phần lớn phịng thí nghiệm có liên quan đến gen DNA thuộc lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trường, y tế, dược phẩm, pháp y … Nguyên tắc kỹ thuật PCR • Kỹ thuật PCR dựa xúc tác enzyme DNA polymerase để nhân đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ hai mạch đơn đoạn DNA Kỹ thuật phát minh nhờ phát Taq polymerase, DNA polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống suối nước nóng Sự tái DNA thể sống Thành phần PCR • DNA khn: mang trình tự cần nhân lên • mồi tổng hợp oligonucleotide (mồi xi mồi ngược) • dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP • Polymerase chịu nhiệt • Mg2+: cofactor enzyme • Dung dịch đệm: ổn định pH lực ion dung dịch phản ứng cho phù hợp với hoạt động enzyme Các giai đoạn phản ứng PCR Có giai đoạn phản ứng PCR chúng đƣợc lặp lại từ 20-40 lần Việc đƣợc tự động hóa nhờ Thermo cycler, thiết bị có khả tăng giảm nhiệt độ ống phản ứng thời gian ngắn Biến tính (denaturation): hai sợi chuỗi xoắn kép duỗi xoắn tách rnhờ nhiệt cao (94-95oC) Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng giảm xuống (55-50oC) để mồi gắn vào sợi DNA tương ứng theo nguyên tắc bổ sung base Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA thực nhờ enzyme DNA polymerase (6575oC) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn từ đầu 3’ – Nhiệt độ (oC) Chu k phn ng PCR Hỗn hợp phản ứng Bắt đầu chu kỳ Nhắc nhắc lại n chu (2) PCR kỳ GĐ GĐ G§ Thêi gian (phót) Chu kỳ nhiệt: Bước 1: 94o C, 30 giây Bước 2: 94o C, 15 giây Bước 3: 55o C, 30 giây Bước 4: 72o C, 1.5 phút Bước 5: lặp lại từ bước 2-4 35 lần Bước 6: 72o C, 10 Bước 7: 4o C f- bảo quản Bước 8: Kết thúc Chu kỳ phản ứng PCR gồm bước lặp lặp lại nhiều lần Nhờ vậy, vài ta thu hàng triệu copy đoạn DNA đó, đủ cho mục đích thí nghiệm khác 10 Ảnh hƣởng chu kỳ nhiệt độ phản ứng  Số lượng chu kỳ phản ứng  Giai đoạn biến tính  Nhiệt độ biến tính  Thời gian biến tính  Giai đoạn gắn mồi  Nhiệt độ gắn mồi  Thời gian gắn mồi  Giai đoạn kéo dài  Nhiệt độ phản ứng kéo dài mạch  Thời gian phản ứng kéo dài mạch Ảnh hƣởng chu kỳ nhiệt độ phản ứng Ảnh hưởng số lượng chu kỳ phản ứng  Số lượng chu kỳ phản ứng phụ thuộc vào:  Lượng DNA khuôn mẫu  Lượng sản phẩm mong muốn  Trong thực tế thường không vượt 40 chu kỳ cho phản ứng PCR vì:  Trong giai đoạn đầu, số lượng tăng theo cấp số nhân  Giai đoạn sau, hiệu khuếch đại giảm do:  Sự phân hủy cạn kiệt thành phần phản ứng  Sự xuất sản phẩm phụ ức chế phản ứng  Các không bắt cặp với mồi mà bắt cặp với  … Ảnh hƣởng chu kỳ nhiệt độ phản ứng Giai đoạn biến tính • Nhiệt độ biến tính: – Nhiệt độ thấp  phân tử DNA khơng biến tính hồn tồn  hiệu khuếch đại thấp – Nhiệt độ cao  phân tử DNA bị phân hủy, DNA polymerase bị hoạt tính  phản ứng không đặc hiệu không xảy – Nhiệt độ biến tính thường sử dụng: 94 – 95oC Ảnh hƣởng chu kỳ nhiệt độ phản ứng Giai đoạn biến tính • Thời gian biến tính: – Thời gian ngắn  phân tử DNA không biến tính hồn tồn  hiệu khuếch đại thấp – Thời gian dài  phân tử DNA bị phân hủy, DNA polymerase bị hoạt tính  phản ứng không đặc hiệu không xảy – Thời gian biến tính thường sử dụng: • Giai đoạn biến tính ban đầu: 3-5 phút • Giai đoạn biến tính chu kỳ: 30-45 giây Ảnh hƣởng chu kỳ nhiệt độ phản ứng Giai đoạn gắn mồi • Nhiệt độ gắn mồi – Nhiệt độ thấp  mồi bám không đặc hiệu  sản phẩm không đặc hiệu – Nhiệt độ cao  mồi khó bắt cặp với DNA khn  sản phẩm ít, khơng có sản phẩm – Nhiệt độ gắn mồi sử dụng thường thấp Tm mồi – Để tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, thường thiết lập phản ứng PCR theo thang nhiệt độ (các phản ứng khác nhiệt độ gắn mồi) Ảnh hƣởng chu kỳ nhiệt độ phản ứng Giai đoạn gắn mồi • Thời gian gắn mồi – Thời gian ngắn  mồi không đủ thời gian gắn vào khuôn – Thời gian dài  tăng bắt cặp khơng xác – Thời gian gắn mồi thường sử dụng 30 giây Ảnh hƣởng chu kỳ nhiệt độ phản ứng Giai đoạn kéo dài • Nhiệt độ phản ứng kéo dài – Phụ thuộc vào loại enzyme kích thước sản phẩm VD: sử dụng Taq DNA polymerase • Đối với sản phẩm có kích thước 6 kb  thường dùng 68oC để tránh enzyme bị biến tính Ảnh hƣởng chu kỳ nhiệt độ phản ứng Giai đoạn kéo dài • Thời gian kéo dài – Thời gian ngắn  trình tự mục tiêu nhân lên khơng hồn chỉnh – Thời gian kéo dài mạch dài  tạo thành sản phẩm không đặc hiệu – Tùy vào kích thước sản phẩm mong muốn loại enzyme sử dụng mà thiết lập thời gian kéo dài mạch phù hợp VD: enzyme Taq DNA polymerase thời gian kéo dài thường sử dụng phút/1kb 4 16 32 64 128 10 256 11 512 12 1024 13 2048 14 4096 15 8192 16 16.384 17 32.768 18 65.536 19 131.072 20 265.144 21 524.288 22 1.048.576 23 2.097.152 24 4.194.304 25 8.388.608 26 16.777.216 27 33.544.432 Khuôn DNA biến tính thành sợi đơn (94oC, phút) Gắn mồi vào chuỗi DNA (30-65oC) 30 giây Chu trình PCR Tách thành sợi đơn DNA (94oC, 30 giây) Tổng hợp chuỗi (65-75oC, 2-5 phút) Ảnh hƣởng thiết bị dụng cụ thực PCR • Thiết bị tiến hành PCR cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ nhanh xác • Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm riêng nên thí nghiệm nghiên cứu cần tiến hành loại thiết bị • Mọi dụng cụ, hóa chất sử dụng cho PCR cần phải sạch, tránh tạp nhiễm Bài tập • Nêu nguyên nhân biện pháp khắc phục cho trường hợp sau: Trường hợp khơng thấy tín hiệu vạch tín hiệu thấp 1: khơng có vạch 2: vạch mờ Trường hợp sản phẩm không đặc hiệu a b Trường hợp tạo vệt tín hiệu a: Xuất vết chất có khối lượng phân tử nhỏ b: Xuất vệt chất có khối lượng phân tử lớn Các ứng dụng chủ yếu PCR • Sử dụng PCR để tách dịng đoạn DNA • Chẩn đốn nhanh, nhạy bệnh di truyền nhiễm trùng (ung thư, virus, vi khuẩn, nấm…) • Giúp xác định giới tính động vật người giai đoạn phôi thai sớm qua phát đoạn gene đặc trưng nhiễm sắc thể giới tính • Là kỹ thuật cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng: xác định trình tự gene, xác định tính đa hình DNA, làm sở cho việc phân tích thị phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật…), phát kiểu đột biến • Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh, xác định nhanh với độ xác cao thủ phạm hình từ dấu vết nhỏ: máu, nước dãi, sợi tóc… • Khơi phục gen nhiều loài sinh vật tồn cách hàng chục triệu năm 46 Bệnh di truyền 644 bp 440 bp 204 bp Phân tích phân tử gia đình có bệnh di truyền gen lặn ... thúc đẩy phát triển Công nghệ sinh học đại? ?? (J Watson) Khái niệm Kỹ thuật PCR phương pháp cho phép nhân nhanh số lượng lớn đoạn DNA Phương pháp có độ nhạy cao ngày trở thành công cụ nghiên cứu đầu... nghiên cứu đầu tay phần lớn phịng thí nghiệm có liên quan đến gen DNA thuộc lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trường, y tế, dược phẩm, pháp y … Nguyên tắc kỹ thuật PCR • Kỹ thuật PCR dựa... pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng: xác định trình tự gene, xác định tính đa hình DNA, làm sở cho việc phân tích thị phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật…), phát