23-01-14 1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014) 1 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Các phương pháp lai phân tử  Phương pháp PCR, ứng dụng  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 2 • Nhân dòng DNA là kỹ thuật dùng để tái sản xuất các đoạn DNA. • Có 2 phương pháp nhân dòng DNA: − sử dụng tế bào chủ − dùng PCR • Một vector là yêu cầu cần thiết để mang đoạn DNA mục tiêu vào trong tế bào chủ. 3 1. Vector nhân dòng 1.1. Khái niệm • Vector là các phân tử được dùng để mang các đoạn DNA/gen đã được tách dòng. − Trong thực tế, một đoạn DNA lạ không thể duy trì và nhân bản trong tế bào chủ mới nếu như nó được chuyển vào tế bào chủ mới chỉ ở dạng một đoạn DNA đơn độc.  Do enzyme DNA polymerase làm nhiệm vụ tái bản DNA không thể khởi đầu quá trình tái bản từ bất kỳ địa điểm nào trên DNA mà chỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là “điểm tái bản” (origins of replication)Các đoạn DNA (hay các gen) muốn tái bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn vào một vector(cloning vectors). Vector nhân dòng thực chất là một phân tử DNA có gốc tái bản và có thể nhân lên trong tế bào chủ đã chọn. 4 1. Vector nhân dòng 1.1. Khái niệm (tiếp…) 23-01-14 2 5 • Chỉ có một điểm nhận biết cho một RE nào đó. – Nếu như số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gây rối loạn cho sự nhân dòng sau này. Một vector nhân dòng sẽ càng có ý nghĩa hơn nếu như nó có thể được cắt nhờ nhiều loại RE và tất nhiên ứng với mỗi loại cũng chỉ có một địa điểm nhận biết. • Phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc – Thí dụ như tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo màu. Điều này cần thiết để có thể chọn lọc được các tế bào đã được chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng mầu của chúng. • Phải có điểm tái bản để đảm bảo sự nhân lên của chúng trong tế bào chủ mới. – Trong một số trường hợp một plasmid có thể được sử dụng làm vector nhân dòng cho hai tế bào chủ không có liên quan với nhau như E.coli và Bacillus subtilis. Các vector hai chức năng này phải có số điểm tái bản lớn hơn 1. 6 1. Vector nhân dòng 1.2. Tiêu chuẩn của vector nhân dòng • Các loại vector nhân dòng khác nhau được sử dụng cho các thí nghiệm nhân dòng khác nhau. • Việc lựa chọn vector phụ thuộc vào kích thước và loại DNA cần nhân dòng. BM CNSH TV – Khoa CNSH 7 1. Vector nhân dòng 1.3. Các loại vector nhân dòng vectors Plasmid-based Virus-based Chromosome-based Phage-based Eukaryotic virus- based YAC BAC MAC Hybrid (phagemid, cosmid …) 8 1. Vector nhân dòng 1.3. Các loại vector nhân dòng 23-01-14 3 Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của một số vector nhân dòng STT Vector Khả n ăng chứa đ oạn DNA (kb) 1 Plasmid <10 kb 2 Bacteriophage 9 – 20 kb 3 Cosmid 33 – 47 kb 4 BAC 100 – 300 kb 5 YAC 100 – 1000 kb 9 • Các tế bào vi khuẩn có thể chứa các DNA ngoài DNA nhiễm sắc thể gọi là các plasmid. • Plasmid thường ở dạng các DNA nhỏ mạch vòng, có khả năng nhân lên độc lập với DNA nhiễm sắc thể. • Một số plasmid có mặt trong tế bào với nhiều bản sao. 10 1. Vector nhân dòng 1.4. Vector plasmid Một số plasmid vector • pBR plasmid • pUC BM CNSH TV – Khoa CNSH 11 “p” : plasmid “BR” : tên của hai nhà khoa học F. Bolivar và R.Rodrigues “332”: số thứ tự. 4363bp Nhóm plasmid pBR 12 23-01-14 4 • Đây là nhóm các plasmid được phát triển từ plasmid pBR322. • Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40% DNA) được cắt bỏ còn phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại. • Ngoài ra, các vị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn DNA ngoại lai (cũng là các vị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC được phân bố tập trung vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS). Nhóm plasmid pUC 13 • Gốc tái bản • Marker chọn lọc • Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS/polylinker) Older cloning vector Thành phần của một plasmid 14 • Là một đoạn DNA với nhiều vị trí nhận biết duy nhất cho các enzyme giới hạn. Việc cắt plasmids với một trong các RE trong vùng MCS không ảnh hưởng gì đến các đặc tình cần thiết khác của vector. • Gene cần nhân dòng được gắn vào vector nhân dòng ở một vị trí giới hạn trong vùng đa nhân dòng. Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS / polylinker) 15 16 23-01-14 5 • Kích thước nhỏ (3-20kb). • Genome đã được giải mã. • Số bản copy cao. • Chứa gen chỉ thị hoặc chọn lọc. − gen kháng kanamycin (kanR) − gen kháng tetracycline (tetR) − gen kháng ampicillin (ampR) − …. • Chứa trình tự nhận biết duy nhất cho nhiều RE. Ưu điểm của plasmid vectors: 17 • Không nhân dòng được các đoạn DNA kích thước lớn. • Thường nhân đoạn 4 - 10 kb. • Hiệu suất biến nạp thường không cao. Hạn chế của vector plasmid 18 • Nhân dòng DNA (DNA cloning) cho phép chọn lọc và sao chép bất kỳ một đoạn trình tự đặc thù của DNA (hoặc RNA) và sản xuất với một lượng không giới hạn • Là bước đầu tiên trong một loạt các thí nghiệm về kỹ thuật di truyền – Tạo thư viện DNA – PCR – Xác định trình tự (DNA sequencing) 19 2. Nhân dòng DNA 1. Tách chiết DNA từ mẫu nghiên cứu, cắt DNA bằng enzym cắt giới hạn để tạo ra các đoạn DNA là nguyên liệu cho quá trình nhân dòng (tách dòng) 2. Gắn các đoạn cắt vào một vector nhân dòng 3. Chuyển nạp các vector nhân dòng sau phản ứng gắn trên vào tế bào sinh vật chủ để nhân bản các đoạn DNA đã được gắn cùng với vector 4. Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân dòng. Từ đây có thể chọn lọc ra các trình tự cần quan tâm. Xử lý vector với enzyme cắt giới hạn hình thành đoạn bổ sung với đoạn DNA cần nhân Đoạn DNA cần nhân dòng đã được xử lý enzyme giới hạn Nối đoạn DNA với vector nhờ enzyme DNA ligase Phân tử DNA tái tổ hợp Chuyển vào tế bào vi khuẩn Nhiễm sắc thể vi khuẩn Phân tử DNA tái tổ hợp 20 2. Nhân dòng DNA 2.1. Các bước cơ bản của nhân dòng gen 23-01-14 6 Bước 1: Cắt DNA mẫu và plasmid bằng RE Xử lý enzyme EcoRI Xử lý enzyme EcoRI 21 2. Nhân dòng DNA 2.2. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 2: Nối mẫu DNA vào pUC19 Mẫu DNA đã được xử lý bằng EcoRI Vector plasmid được xử lý bằng EcoRI 22 Quá trình lai thực hiện nhờ DNA ligase 2. Nhân dòng DNA 2.2. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 3. Biến nạp • Biến nạp (transformation): là quá trình chuyển DNA ngoại sinh vào trong 1 tế bào. • Có một số phương pháp để biến nạp DNA vào vi khuẩn, 2 phương pháp thường sử dụng đó là: – Phương pháp hóa học sử dụng CaCl 2 và sốc nhiệt để thúc đẩy DNA đi vào trong tế bào. – Dùng xung điện (electroporation) để kích thích quá trình tế bào tiếp nhận DNA. 23 2. Nhân dòng DNA 2.2. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Biến nạp theo phương pháp dùng CaCl 2 và sốc nhiệt 24 23-01-14 7 Biến nạp bằng xung điện 25 Bước 4. Chọn lọc • Nuôi dịch khuẩn vừa biến nạp trên môi trường chọn lọc. 26 2. Nhân dòng DNA 2.2. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Các sản phẩm thu được sau biến nạp plasmid + đoạn DNA ngoại Kháng ampicillin Plasmid không mang đoạn DNA ngoại Kháng ampicillin Không mang plasmid Không kháng ampicillin Làm thế nào để phân biệt và chọn lọc được sản phẩm mong muốn? 27 Chọn lọc trắng xanh Dựa vào hệ thống lac Operon (điều khiển phản ứng đối với lactose trong tế bào E. coli) 28 23-01-14 8  - galactosidase Lactose Galactose + Glucose  - galactosidase -D-glucuronid + H2O Glucuronic acid + Glucose  - glucuronidase X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-galactoside  - galactosidase 5-Brom-4-chlor-indigo Không màu Màu xanh sẫm http://www.eppendorfna.com/applications/images/gel _cleanup1.jpg 29 LacZ gene promotor RNA pol. Gene LacZ ở trạng thái hoạt động DNA LacZ mRNA Ribosome β-galactosidase RNA Protein X-gal Khuẩn lạc xanh Khuẩn lạc trắng X-gal 30 31 LacZ promotor operator Repressor Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc LacZ promotor RNA pol. RNA pol. IPTG IPTG IPTG LacZ promotor operator IPTG IPTG RNA pol. IPTG X-gal beta-galactosidase X + galactose MÀU TRẮNG MÀU XANH 32 23-01-14 9 X XX X X Plasmid không chứa đoạn DNA ngoại Plasmid + đoạn DNA ngoại Không chứa plasmid LacZ Insert Khuẩn lạc TRẮNG Khuẩn lạc XANH Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc P O 33 Như vậy: • Chỉ các vi khuẩn nào có chứa plasmid đã biến nạp thì tồn tại được trên môi trường và hình thành khuẩn lạc (vì có plasmid chuyển nạp thì mới có gen chịu kháng sinh). • Do cấu trúc của plasmid, vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hoá -galactosidase) sẽ là vùng bị cắt để gắn DNA ngoại vào, cho nên các khuẩn lạc có mầu xanh là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn DNA ngoại lai, còn khuẩn lạc có màu trắng chính là khuẩn lạc có chứa 1 đoạn DNA cần nhân dòng được ghép vào. 34 2. Nhân dòng DNA 2.2. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 4: (tiếp ) • Chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong môi trường lỏng có bổ sung ampicillin để nhân nhanh sinh khối. • Tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra kết quả nối DNA vào plasmid (khẳng định sự có mặt của đoạn DNA mong muốn trong plasmid) bằng các phương pháp như PCR, sử dụng RE. 35 2. Nhân dòng DNA 2.2. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Movie on making recombinant DNA 36 23-01-14 10 37 1. Vẽ sơ đồ cấu trúc và giải thích các đặc điểm chính của vector pBR322 khi nó được sử dụng làm vector để nhân dòng một đoạn DNA? 2. Giải thích vai trò các thành phần của một plasmid: (a) các gen kháng kháng sinh, (b) gốc tái bản, (c) vị trí đa nhân dòng được sử dụng như thế nào trong kỹ thuật nhân dòng? 3. Vector nhân dòng là gì? Nêu các đặc trưng chung của một vector dùng để nhân dòng DNA? 4. Trình bày các bước của kỹ thuật nhân dòng gen bằng vector plasmid pUC19. Giải thích làm thế nào có thể chọn lọc được dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp? CÂU HỎI ÔN TẬP . 23-01-14 1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014) 1 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)  Chức năng. dụ như tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo màu. Điều này cần thiết để có thể chọn lọc được các tế bào đã được chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng mầu. sau phản ứng gắn trên vào tế bào sinh vật chủ để nhân bản các đoạn DNA đã được gắn cùng với vector 4. Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân dòng. Từ đây